【支原体核酸法】用定量标准品
目前，支原体核酸检测法（常规pcr、荧光定量pcr）应用较为广泛，尤其在生物制药和细胞治疗领域，可以替代传统的培养法和dna染色法。但同时，各种品牌的支原体pcr和qpcr检测试剂盒又良莠不齐，因此，对核酸法本身进行方法学验证是非常必要的。
上对支原体核酸法的验证提出了三项要求：检测限、特异性和耐用性。在检测限方面，欧洲药典除了规定要达到10cfu/ml或100cfu/ml外，也指出可以用等量的支原体核酸拷贝数来表示。这时就需要选用合适的支原体核酸标准品。
的微生物污染防控公司minerva biolabs（以下简称德国mb公司），专门提供包括欧洲/日本药典9种支原体在内的pcr定量标准品共14种，可进行10倍梯度稀释，制备标准曲线，确定核酸法的检测限，因而广受药厂的青睐。
德国mb公司提供的pcr定量标准品信息如下：
德国mb公司提供的pcr定量标准品信息如下：pcr定量标准品的物种 货号
口腔支原体 52-0112
鸡败血支原体 52-0115
莱氏无胆甾原体 52-0116
发酵支原体 52-0117
肺炎支原体 52-0119
关节液支原体 52-0124
*支原体 52-0129
猪鼻支原体 52-0130
柠檬螺原体 52-0164
唾液支原体 52-0103
百日咳杆菌 52-5571
大肠埃希菌 52-0083
嗜肺军团菌 52-0101
铜绿假单胞菌 52-0071
一、试剂盒组分：
试剂盒组分 数量 盖子颜色
pcr定量标准品1×108基因组拷贝/管 1管冻干粉 绿色
tris缓冲液，10mm tris，ph8.5（用于溶解和稀释标准品） 2ml×3管 白色
说明：2-8℃保存。使用前，标准品溶解后在-18℃以下保存。避免反复冻融。
、质控保证
微生物在液体培养基中培养，并在对数生*末期收集。dna用酚氯fang抽提，继而用过滤柱纯化。dna纯度用分光光度计法测量，保证od260/280≥1.8。微生物物种用sanger测序法确定。
纯化dna的定量采用小牛胸腺dna标准品进行光密度测量，进而用荧光法证实。dna终稀释，并调整为1×108基因组拷贝/管。稀释倍数用qpcr分析证实。
每个批号的产品均提供质控证明。三、操作步骤：
1、标准品复溶
（1）所有管短时离心。
（2）加入100μl tris缓冲液到带绿盖的管中。
（3）室温静置5分钟。
（4）涡旋振荡10秒，再离心5秒。
（5）使用适当体积的dna溶液直接用于pcr或直接稀释，用于制备dna标准曲线
2、制备10倍稀释的dna标准曲线
（1）使标准品和tris缓冲液室温达到平衡。
（2）标记每个1.5ml离心管。每个管加入90ml tris缓冲液。
（3）标准品混匀离心。
（4）标准品1：加10μl标准品母液到第1管，盖盖并混匀。简要离心。
（5）标准品2：从第1管中取出10μl到第2管，盖盖并混匀。简要离心。
（6）标准品3：从第2管中取出10μl到第3管，盖盖并混匀。简要离心。
（7）下面的管均重复以上步骤。*制备6个标准品（梯度稀释）。
3、pcr扩增溶解的dna可直接用于常规pcr。德国mb公司*venor®gem pcr试剂盒用于支原体检测，或onar®bacteria pcr试剂盒用于细胞培养中的细菌检测。对于qpcr，使用梯度稀释的dna标准品，可制备标准曲线。大多数qpcr软件允许通过标准曲线进行定量分析。这依赖于正确的设置，包括标准曲线的参数。为便于正确定量，要确定你的标准曲线样品。使用者可以试用下列参数用于设置。体积决定了每个pcr反应的基因组拷贝数。
反应管编号 2μl样品 5μl样品 10μl样品
1 2×105基因组拷贝 5×105基因组拷贝 1×106基因组拷贝
2 2×104基因组拷贝 5×104基因组拷贝 1×105基因组拷贝
3 2×103基因组拷贝 5×103基因组拷贝 1×104基因组拷贝
4 200基因组拷贝 500基因组拷贝 1000基因组拷贝
5 20基因组拷贝 50基因组拷贝 100基因组拷贝
6 2基因组拷贝 5基因组拷贝 10基因组拷贝
4、评估
使用梯度稀释，qpcr检测后ct值会随着dna浓度下降而升高。通过ct值和dna样本量产生一条标准曲线，未知样本的浓度通过标准曲线可以计算。下列的扩增曲线是用德国mb公司的venor®
gem qep试剂盒绘制的。所用仪器为cfx96 touch荧光定量pcr仪。
图1. 梯度稀释标准品的扩增曲线。标准品为发酵支原体的106至10个基因组拷贝数。图2.用bio-rad cfx manager软件产生的标准曲线。总之，pcr定量标准品可提供低拷贝数的dna标准品，因而可精zhun确定核酸法的检测限。而10cfu的灵敏度标准品只能观察是否能达到这一阈值，而无法确定终为多少。从这个角度说，pcr定量标准品具有自己*的优势。
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的微生物污染防控公司minerva biolabs（以下简称德国mb公司），专门提供包括欧洲/日本药典9种支原体在内的pcr定量标准品共14种，可进行10倍梯度稀释，制备标准曲线，确定核酸法的检测限，因而广受药厂的青睐。
德国mb公司提供的pcr定量标准品信息如下：
德国mb公司提供的pcr定量标准品信息如下：pcr定量标准品的物种 货号
口腔支原体 52-0112
鸡败血支原体 52-0115
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（5）标准品2：从第1管中取出10μl到第2管，盖盖并混匀。简要离心。
（6）标准品3：从第2管中取出10μl到第3管，盖盖并混匀。简要离心。
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