多色类器官宝典：肺癌类器官的培养与多色鉴定
一、肺癌类器官构建——organotial人肺癌类器官培养基试剂盒（abs9443）
（1）取材后的组织须放在预冷的（2-8°c）组织保存液的取样瓶中，快速转运至洁净实验室进行组织处理和细胞分离，拍照并登记信息。
（2）准备若干培养皿，加入 4℃预冷的原代培养缓冲液备用。
（3）取样瓶消毒，将组织放入培养皿中，利用原代培养缓冲液清洗三次后，去除杂质，利用眼科剪或手术刀将组织剪切成体积约为1-3mm3的组织块。
（4）组织用人肺癌原代组织消化液消化，37℃震荡消化10-20min（消化过程中随时观察消化情况）。
（5）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或70um以下的细胞簇后，加入三倍体积原代培养缓冲液终止消化。
（6）使用100um孔径的筛网（abs7009）进行过滤，将滤液收集后，于300g富集离心5min后移去上清，添加原代培养缓冲液重新重悬离心。
（7）基质胶计算：第6步后观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶（abs9495）重悬铺板。
（8）24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。
（9）将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加人肺癌类器官培养基（恢复室温）进行培养。
二、多重荧光免疫组化鉴定——六色多重荧光免疫组化染色试剂盒（abs50014）
（1）样本制备：类器官样本制备，参考类器官实操大本营之——固定包埋
（2）烤片：60℃烤片30min。
（3）脱蜡、水化：二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——100%乙醇（5min）——100%乙醇（5min）——95%乙醇（3min）——85%乙醇（3min）——75%乙醇（3min）——去离子水（5min)。
（4）抗原修复：取200ml抗原修复液，加入染色盒中，将组织切片置于染色盒内耐高温塑料切片架上，置于高压锅内加热至饱压，然后继续加热5min，关闭电源，10min后取出染色盒，室温冷却30min，画上阻水圈，置入pbst浸洗3次，每次3min。
（5）阻断内源性过氧化物酶：每切片加100μl3% h2o2，室温下孵育10min，pbst浸洗3min×3次。
（6）封闭：除去pbst液，每张切片加100μl 5% 山羊血清封闭液，室温孵育30min，除去封闭液。
（7）一抗孵育：每张切片加100μl一抗工作液，室温保湿孵育1h，pbst浸洗3min×3次。
（8）二抗孵育：除去pbst，每张切片加100μl二抗，室温保湿孵育15min，pbst浸洗3次，每次3min。
（9）染料孵育：除去pbst，每张切片加100μl现配的1*染料工作液（使用信号放大液按1:100稀释），孵育10min后，置入pbst内洗涤，室温浸片洗涤3次，每次3min。
（10）抗体洗脱：抗体洗脱液（abs994）37℃ 预热，滴加少量抗体洗脱液覆盖样本，室温放置3~5min；弃去洗脱液，再次滴加足量的洗脱液覆盖样本，37°c 孵育20min；pbst浸洗3次，每次3min。
（11）重复步骤（6）-（10），直至所有目标抗体染色完成。
（12）核染：滴加1*dapi工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min后，用1*pbst浸洗玻片3次，每次2min。
（13）封片：滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡。
（14）扫描成像，数据分析。
absin肺癌类器官多色风采展
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类器官培养
货号
品名
规格
货期
abs9443
organotial人肺癌类器官培养基试剂盒
1kit
1-2周
abs7009
100um细胞过滤器（160目，黄色）
100个/箱
现货
abs9495
基质胶（低因子、无酚红）
1.5ml*4
现货
abs7035
标准透明24孔细胞培养板
50个/盒
现货
abs44056210
琼脂糖
100g
现货
多重荧光免疫组化鉴定
abs50014
六色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔通用二抗）
20t/100t
现货
abs9247
edta抗原修复液（50×）
100ml
现货
abs9248
柠檬酸钠抗原修复液（50×）
100ml
现货
abs9333
过氧化物酶封闭液（h2o2法）
100ml
现货
abs933
山羊血清
10ml/50ml
现货
abs1
ttf-1、napsin a、p63、p40...（爱必信组化专用抗体）
100ul
1-2周
abs9299
一抗二抗稀释液
100ml/1l
现货
abs9340
pbst（1×，ph7.4）
500ml
现货
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