奥林巴斯光学显微镜的对比度
当成像在光学显微镜标本，在强度和/或颜色的差别创建图像的对比度，这允许单独的特征和标本的细节变得可见。 对比度被定义为在图像和相对于整个背景强度相邻背景之间的光强度之差。 在一般情况下，是由人眼所需要的0.02（2％）的低对比度值来区分图像和它的背景之间的区别。 对于其他检测器，如电影，视频摄像机，或光检测器（ccd和cmos器件），小对比度往往是不同的值。 与每个检测器中，信噪比（噪声是所有在缺乏图像信息的光学系统的光的）必须足够大，以连贯图象的形成的角度来解释。
通过光，亮度，反射率，双折射，光散射，衍射，荧光或颜色变化的吸收在试样产生对比度一直在明显微镜成像样品的典型装置。 一个细节中脱颖而出映衬或其他邻近的细节的能力是标本对比度的量度。 在一个简单的公式而言，对比度可以被描述为：
对比度百分比（c）= ((i(s) - i(b)) × 100)/i(b)其中i(b)是背景的强度，i(s)是检体的强度。 从这个等式中，显而易见的是，样品的对比度是指图像中的和低强度之间的关系。 在图1中所示的曲线示出了背景强度的对比度的效果。 当背景是一个非常暗灰色颜色（i(b)等于0.01），在图像亮度变化小产生相反的大变化。 通过减轻的背景有点浅灰色（i(b)等于0.10），在图像亮度的微小变化提供对比一个有用的范围。 在仍然较亮的背景颜色（i(b)> 0.20），图像的对比度是相对不敏感的背景强度和大的变化在i(b)产生仅小的增加或图像对比度减小。
虽然在现代显微镜发现该光学系统可以是能够以高倍率产生高分辨率的图像的，这种能力是没有图像中的足够的对比度毫无价值。 反差不是标本的固有特性，但依赖于光检体和连接到其，以可靠地记录与检测这个图象信息的能力的光学系统的效率的相互作用。 在显微镜的光学系统的图像对比度控制取决于几个因素，孔径光阑的主要的设置，在光学系统的像差的程度，所用的光学对比系统，检体的种类，和光学检测器。 有几个在显微镜允许的对比度调节。 这些包括外地光圈，聚光光圈，视频检测器，电子照相机伽玛，胶片伽玛，印刷纸伽玛，图像处理实时附加放大率，以及检体染色的。
因为人眼感知在其图像中产生的对比度的对象，可以很容易地引入歧途除非有发生，以产生所述图像中的对比度的光的事件的知识。 图2示出了包含下不同对比度模式用光学显微镜成像透明，无色人颊细胞相同的视场三个显微照片：明场，相差和霍夫曼调制对比。 这是很明显的是，三个图像出现不同的，因为这些变化，一个显微镜可能在从各视场不同的结论。 在图2（a）中示出的细胞在明模式下操作的显微镜成像与聚光镜孔关闭足以使试样边缘可见。
使用相差光学面颊细胞的相同视场示于图2（b）。 注意深色内区域和对象的边缘周围明亮的外地区，如细胞膜和细胞核（所谓的光晕，而且工件）。 在此视图中，难以小区的边缘，来解释图像中的暗区和亮区的原因。 该细胞也显得比较平淡。 后，在图2（c）所示的单元使用霍夫曼调制对比，其中图像的一侧是暗，而其相对侧是明亮的，导致了伪三维对象的感知进行成像。 在图2中的每个视场提供了不同的试样的图像，并导致不同的解释，这只能提供关于显微镜如何创建这些图像知识来解密。
在光学显微镜，尤其是未染色或物质生活的许多标本，反差如此之差，该标本仍然基本上是无形不顾物镜的解决或明确分开细节的能力。 通常情况下，为这样的标本，它不是通过杀死或化学染料或固定剂处理，以改变它们是很重要的。 这种必要性导致显微镜来试验对比，以试图改善样品的能见度和带来更多细节图像，而不改变试样本身增强技术超过一百年。 它是一种常见的做法，以减少推荐的大小低于聚光镜孔径光阑或降低台下聚光镜，以增加样品的对比。 不幸的是，虽然这些演习确实会增加对比度，他们也严重降低分辨率和清晰度。
要考虑的是如何光与物质讨论控制在光学显微镜下的对比度的方法之前，进行交互的特性是有用的。 光负责照亮样品可以是空间相干的，非相干或部分相干的。 例如，光束可以在狭缝或环的形式被成形，并可以由在所有方向垂直于传播方向或在由于偏振单一方向振动所选波长。
一些样品被认为振幅对象，因为它们吸收光部分或*，且因此可以使用传统的明场显微术可容易地观察到。 天然被着色或人工化学色染料染色的人也可以用显微镜清楚地成像。 这些污渍或自然的色彩吸收白光穿过的某些部分和传输或反映其他颜色。 通常情况下，污渍相结合，产生对比的颜色，如蓝色苏木染色的细胞核与细胞质伊红的粉红色结合。 它是利用上不容易吸收光线，从而使肉眼可见这样的图像标本渍的普遍做法。
其他标本不吸收光相位对象引用。 因为人眼只能检测的强度和颜色差异，相位的变化，由于对象必须被转换成强度的差异。 相位标本是由几个标准，包括它们的形状（通常为圆形或平的），内部光散射元件，厚度的密度，以及*的化学或电的结构特性（共同分组为折射率）表征。 厚的样品可以是相对清晰，并且只包含几个光散射元件，或者它们可以包含不通过光，使检体有效不透明的透射照明许多散射元件。 这些标本通常被称为反射光的标本。
当考虑的光学方法，以提高检体相反，它是有用的考虑，可以被操纵以创建的这些特征的强度变化，使它们可见的试样的各种特性。 一个主要的问题是该对象的特性将在的一组的情况下被转换成一个不同的强度。
样品的细节和边缘具有一个大小接近的成像光的波长将衍射或散射光，只要是在试样及其周围介质（环绕声）之间的折射率的差。 折射率被定义为速度的比通过空气或真空通过对象由光速除以点亮。 因为光穿过的任何材料的速度是小于光在真空中的速度，折射率总是超过用于与显微镜检查标本的1.0值。 为了解决物体之间的小的距离，并以再现它们的形状与合理的保真度，衍射光的大角度必须由显微镜物镜捕获。
通过物镜聚集衍射（或偏离）光必须进入在图像平面上的锐聚焦，以便产生样品详细地，如图3所示。在该图像平面上，包括所述衍射光的光波经受干扰与非衍射光。 光的干扰之后的能见度很大程度上取决于光照射样品的一致性，与能见度通过增加一致性比例增加。 在光学显微镜，聚光镜孔径光阑开口尺寸控制光射到试样上的空间相干性。 减小光圈开口尺寸产生更大的空间相干性。
显微镜长期以来依靠降低聚光镜孔径光阑开口尺寸增加阶段标本颗粒和边缘的度。 对比度为振幅对象也可以由聚光光圈的适当的调整提高。 不管它们是否属于一个幅度或相位标本小物体，边和颗粒将衍射光。 *衍射光的一部分被物镜（见图3）由于物镜的数值孔径限制捕获。 未收集剩余的衍射光表示丢失的图像信息。 用于聚光镜孔径光阑开口尺寸正确的设置是增强的标本图像对比度和引进衍射工件之间的折衷。 这些表现在分辨率，衍射环的叠加，并且在不在共同焦点检体从区域始发其它不希望的光学效果的损失。 由于衍射极限逼近，图像对比度变得更低为研究对象的细节变得越来越小，空间频率变大。
井上和弹簧所描述的图像对比度的比率标本对比度和在由实际和理想正弦图像时作为空间频率的函数作图的光学传递函数（otf）所占据的位置的相移。 在光从样本分布变得正弦情况下，该光学传递函数的模量变得调制传递函数（mtf）。 作为空间频率的增加，调制传递函数减小和标本的对比度降低。
对于每一个物镜，具体的调制传递函数是依赖于物镜的设计和数值孔径，对比度生成，照射光的波长的模式，和台下聚光镜的数值孔径。 物镜后侧焦点面的边缘充当用于衍射光的低通滤波器，其必须在图像平面被聚焦为发生并形成颗粒或边缘的图像的干扰。 在中间像平面聚焦显微镜带来这些衍射光波在一起。 的光的波前相对于所述检体的角度决定困难的在聚焦在光滑圆形表面，它通常不含有衍射点的顶部或底部的程度。 然而，球形标本或纤维的边缘容易集中，因为边缘接口是在足够的角向波前和衍射的光。
当讨论相位标本，我们将定义一个对象作为检体的任何解析部。 如图4所示。在该图中的许多对象将是平的或板状，该对象具有的厚度（t）和一个折射率，n(s)。 周围介质的折射率为n(m)。
光穿过与光路的检体，op = t（n(s)），并通过用光学路径周围介质，op = t（n(m)）。 的光程差（opd）可以表示为：
opd = (tn(s) - tn(m)) = t(n(s) - n(m))与相差之中：
δ = (2π/λ)(opd)其中π是一个常数（3.），λ是光照射在试样的波长。 光程差是两方面的产品：所述厚度（t）和在折射率（n）之差。 的opd常常可以是即使对象物的厚度是相当薄相当大。 另一方面，当样品的折射率和周围介质相同，则opd是零，即使试样的厚度是非常大的。 在这种情况下，光穿过对象行进仅仅延迟（相位差）相对于通过所述环绕的相等厚度的光。 相区别并不被人眼检测到。
在相差显微镜被设计为采取的检体，并在周围介质的对象之间的相位差的优势。 然而，这不是一个简单的相位差是必要的，但也从试样衍射必须发生在相差显微镜工作。
相位物体的见的形状是连续变化的光路或密度，如在图5中示出在这种情况下的半球形试样之一，相位物体的侧面可通过一个棱镜形状数学近似，如下面所讨论。 相位对象的图5中的折射率n（s）和周围介质的， 正（ 米 ）。 在形状自由基几何转变为相位物体在边缘a和b仅发生（见图5的（a））。 入射光撞击物体垂直于平面ab，而平面波阵面是平行于ab。
在1边界（图5中的圆形相对象的顶点（a））的基本平行于入射光波前而在a和b的边界是垂直的。 区2〜4是通过一个切线限定于相位物体的圆形表面（图5（b））的微型棱镜。 的“棱镜”的角度是在区域2比在区域4，它是相对的区域4'较小。 在边缘a和b的衍射是的。
因而，弯曲的对象是由许多棱镜和对象的相对侧的相反方向有取向棱晶。 陡的棱镜是在球形物体的赤道，同时与至少斜率棱镜位于顶部和底部。 这些微型棱镜组成的光学梯度：
og（光学梯度）=φ = α(n(s) - n(m))其中α是切线相对于平面波阵面的角度。 请注意，光学梯度是两个方面的产品：该光穿过侧之间的角度（α），并且在折射率差(n(s) - n(m))。 通过棱镜传递光通过所述角φ（见图5（c）和图5（d））的变化方向。 在方向上的变化可能是大的，即使在斜坡或边界梯度可能很小，如果在折射率的差大。 如果折射率相同，则光波穿过无折射的相位对象。 光出射棱镜的方向是依赖于相位物体（n（s））和其周围介质之间的折射率的相对差（n（ m ）;参见图5（c）和图5（d））。
正如我们上面所讨论的，圆润的阶段对象不断变化的光梯度，以及每一个人的光学梯度“棱镜”创建一个光偏转的角度不同。 图5（c）示出偏转方向，当周围介质的折射率比相位物体更大(n(m) > n(s))，和图5（d）示出的方向时则相反 (n(m) < n(s))。 偏转，φ，所述的角度是成正比的切线角度（α）和折射率差(n(s) - n(m))，使得：
tan φ = tan α (n(s) - n(m))对于小角度：
φ = α (n(s) - n(m))（弧度）到当相位物体的折射率超过周边介质的，关于该对象的每个斜率大小相等的梯度偏转以相同的角度概括光学梯度的边界，“棱镜”的效果。 此偏转角依赖于相对折射率差和几何切线角度（α）。 当介质(n(m)) 的折射率比所述对象 (n(s))的折射率越大，偏转距离时，情况正好相反的对面。 当没有梯度，有通过没有光偏转。
光可通过多种机制与样品相互作用以产生图像对比度。 这些包括从表面反射，吸收，折射，偏振，荧光和衍射。 相反，也可以通过照相或数字电子技术增加了显微镜的光学元件和照明模式的物理改性以及终图像的操纵。 下面的讨论突出了检体和光之间的各种相互作用和回顾一些已开发，以提高检体的对比光学显微技术。
当入射的光线照射的不透明表面，被反射的方式，是于该表面的地形。 非常光滑的表面在等于入射光，被称为镜面反射的机制的角度反射光。 不均匀或漫反射表面趋向于通过被称为漫反射现象的所有可能的角度反射光，从而导致进入物镜的光的量减少。 反射光显微镜对比度可通过仔细的样品制备得到增强。 金相样品常常蚀刻反应性液体和气体，以揭示晶粒边界和/或抛光以提高反射到显微镜的光的量。 渍，在荧光染料，薄膜，和金属涂层的形式，也可用于引入在反射光显微镜标本的对比度。 双折射标本可利用偏振光的反射光，透明的相位对象通常的观测使用诸如反射微分干涉对比，暗场照明，和霍夫曼调制对比受试者进行成像。
人眼对试样的幅度和波长的差异非常敏感。 出于这个原因，许多样品被切成非常薄的切片（从1-30微米厚），并用化学染料染色以提高对比度和居住标本内的结构之间进行区分。 这项技术已被用生物标本数百年来比较常用。 染料选择性地从一个或几个波长吸收光并且通过或反射所有其它波长。 一个例子是蓝色染料吸收所有可见光波长带的蓝色的例外，它是从反射并通过试样传播。 生物样品的内部结构元件通常染色用染料以选择性染色这些元素的混合物，增加其对材料的背景下，或者是透明的或染色的不同的颜色的对比。
这些技术也适用于荧光染料，其可用于增加在标本对比度具有高度特异性。 当荧光标本用可见光或近紫外光的一个波长的刺激，他们经常发光的波长更长，并由此成为可见的或相对于在现场或背景（图6）的其他对象对比。 荧光显微镜的技术中详细的显微镜底漆的另一部分进行讨论。
染色的标本的增加对比度的早期和目前使用的方法是利用色彩对比滤光片，雷登涂漆明胶平方（来自kodak），或干涉滤光器中的光路。 例如，如果检体与红染剂染色，绿色过滤器会变暗红色区域从而增加对比度。 另一方面，绿色过滤器将减轻任何绿色染色区域。 彩色滤光片是非常有价值的艾滋病标本的对比，尤其是当黑白显微摄影是我们的物镜。 绿色过滤器是用于消色差物镜，这是球绿光纠正，相差的物镜，这是专为波长假设使用的绿光操纵使用特别有价值，因为相标本通常是透明和缺乏固有的颜色。
各向异性材料通常表现出两个或更多的折射率，并因此被称为双折射，或双重折射。 其中包括在这一类中的样品是矿物质，晶体（其表现出高度的结构对称性的），纤维，毛发，和其它生物标本。 当光线进入一个非光学各向异性晶体的轴线（比光学轴以外的轴），其被折射到每个两条射线与以直角彼此面向其振动方向极化，并以不同的速度行进。 所得光波被极化，并在显微镜分析器重新组合以产生双折射的试样都高度着色和包含的对比度的显著量的图像时可产生干扰。
活标本和其他阶段的对象，这往往产生于明照明查看时较差的图像，是由光学，而不是下相差，霍夫曼调制对比度和微分干涉对比照明观察化学手段清晰可见。 这些技术需要在显微镜特殊的光学元件，但通常会产生足够的对比度的图像显示了有关试样结构的重要细节。 这些对比度增强技术的更深入的讨论可以在我们可以找到专门的显微镜技术部分。
用于对比度改进另一种简单的技术涉及的折射率从该样品的基本上不同的安装介质的选择。 例如，硅藻可以安装在各种对比增强介质，诸如空气或商业介质苏合香的。 在折射率差提高了这些无色对象的对比度，并使它们的轮廓和斑纹更可见。 以下部分描述了许多由现今显微镜用于提高标本的对比更复杂的技术。
对比增强技术 标本
类型 成像
技术
透射光
透明标本
相对象
细菌，精子，
在玻璃容器中的细胞，
原生动物，螨，纤维等 相差
微分干涉对比（dic）
霍夫曼调制对比
斜照明
光散射对象
硅藻，纤维，毛发，
淡水微生物，
放射虫，等等。 莱茵照明
暗场照明
相差和dic
光折射标本
胶体悬浮液
粉末和矿物质
液体 相差
分散染色
dic
振幅标本
染色组织
当然彩色标本
毛发和纤维
昆虫和海藻 明场照明
荧光样品
在组织培养细胞
荧光染色切片
涂片和价差 荧光照明
双折射标本
矿物薄切片
液晶
熔化和再结晶化学品
毛发和纤维
骨骼和羽毛 偏光照明
反射光
镜面（反射）表面
薄膜，反射镜
抛光金相试样
集成电路 明场照明
相差，dic
暗场照明
弥漫性（非反射）表面
薄和厚膜
岩石与矿物
毛发，纤维和骨
昆虫 明场照明
相衬，dic
暗场照明
振幅表面特征
染色纤维
弥漫金属标本
复合材料
聚合物 明场照明
暗场照明
双折射标本
矿物薄切片
毛发和纤维
骨骼和羽毛
单晶
定向膜 偏光照明
荧光样品
固定细胞
荧光染色切片
涂片和价差 荧光照明
表格1表1列出所选择的对比度增强技术（多个）的用于各种标本和材料进行了研究与两个发射和反射光显微术的摘要。 该表可被用作粗略的指导接近在光学显微镜特定成像问题。
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通过光，亮度，反射率，双折射，光散射，衍射，荧光或颜色变化的吸收在试样产生对比度一直在明显微镜成像样品的典型装置。 一个细节中脱颖而出映衬或其他邻近的细节的能力是标本对比度的量度。 在一个简单的公式而言，对比度可以被描述为：
对比度百分比（c）= ((i(s) - i(b)) × 100)/i(b)其中i(b)是背景的强度，i(s)是检体的强度。 从这个等式中，显而易见的是，样品的对比度是指图像中的和低强度之间的关系。 在图1中所示的曲线示出了背景强度的对比度的效果。 当背景是一个非常暗灰色颜色（i(b)等于0.01），在图像亮度变化小产生相反的大变化。 通过减轻的背景有点浅灰色（i(b)等于0.10），在图像亮度的微小变化提供对比一个有用的范围。 在仍然较亮的背景颜色（i(b)> 0.20），图像的对比度是相对不敏感的背景强度和大的变化在i(b)产生仅小的增加或图像对比度减小。
虽然在现代显微镜发现该光学系统可以是能够以高倍率产生高分辨率的图像的，这种能力是没有图像中的足够的对比度毫无价值。 反差不是标本的固有特性，但依赖于光检体和连接到其，以可靠地记录与检测这个图象信息的能力的光学系统的效率的相互作用。 在显微镜的光学系统的图像对比度控制取决于几个因素，孔径光阑的主要的设置，在光学系统的像差的程度，所用的光学对比系统，检体的种类，和光学检测器。 有几个在显微镜允许的对比度调节。 这些包括外地光圈，聚光光圈，视频检测器，电子照相机伽玛，胶片伽玛，印刷纸伽玛，图像处理实时附加放大率，以及检体染色的。
因为人眼感知在其图像中产生的对比度的对象，可以很容易地引入歧途除非有发生，以产生所述图像中的对比度的光的事件的知识。 图2示出了包含下不同对比度模式用光学显微镜成像透明，无色人颊细胞相同的视场三个显微照片：明场，相差和霍夫曼调制对比。 这是很明显的是，三个图像出现不同的，因为这些变化，一个显微镜可能在从各视场不同的结论。 在图2（a）中示出的细胞在明模式下操作的显微镜成像与聚光镜孔关闭足以使试样边缘可见。
使用相差光学面颊细胞的相同视场示于图2（b）。 注意深色内区域和对象的边缘周围明亮的外地区，如细胞膜和细胞核（所谓的光晕，而且工件）。 在此视图中，难以小区的边缘，来解释图像中的暗区和亮区的原因。 该细胞也显得比较平淡。 后，在图2（c）所示的单元使用霍夫曼调制对比，其中图像的一侧是暗，而其相对侧是明亮的，导致了伪三维对象的感知进行成像。 在图2中的每个视场提供了不同的试样的图像，并导致不同的解释，这只能提供关于显微镜如何创建这些图像知识来解密。
在光学显微镜，尤其是未染色或物质生活的许多标本，反差如此之差，该标本仍然基本上是无形不顾物镜的解决或明确分开细节的能力。 通常情况下，为这样的标本，它不是通过杀死或化学染料或固定剂处理，以改变它们是很重要的。 这种必要性导致显微镜来试验对比，以试图改善样品的能见度和带来更多细节图像，而不改变试样本身增强技术超过一百年。 它是一种常见的做法，以减少推荐的大小低于聚光镜孔径光阑或降低台下聚光镜，以增加样品的对比。 不幸的是，虽然这些演习确实会增加对比度，他们也严重降低分辨率和清晰度。
要考虑的是如何光与物质讨论控制在光学显微镜下的对比度的方法之前，进行交互的特性是有用的。 光负责照亮样品可以是空间相干的，非相干或部分相干的。 例如，光束可以在狭缝或环的形式被成形，并可以由在所有方向垂直于传播方向或在由于偏振单一方向振动所选波长。
一些样品被认为振幅对象，因为它们吸收光部分或*，且因此可以使用传统的明场显微术可容易地观察到。 天然被着色或人工化学色染料染色的人也可以用显微镜清楚地成像。 这些污渍或自然的色彩吸收白光穿过的某些部分和传输或反映其他颜色。 通常情况下，污渍相结合，产生对比的颜色，如蓝色苏木染色的细胞核与细胞质伊红的粉红色结合。 它是利用上不容易吸收光线，从而使肉眼可见这样的图像标本渍的普遍做法。
其他标本不吸收光相位对象引用。 因为人眼只能检测的强度和颜色差异，相位的变化，由于对象必须被转换成强度的差异。 相位标本是由几个标准，包括它们的形状（通常为圆形或平的），内部光散射元件，厚度的密度，以及*的化学或电的结构特性（共同分组为折射率）表征。 厚的样品可以是相对清晰，并且只包含几个光散射元件，或者它们可以包含不通过光，使检体有效不透明的透射照明许多散射元件。 这些标本通常被称为反射光的标本。
当考虑的光学方法，以提高检体相反，它是有用的考虑，可以被操纵以创建的这些特征的强度变化，使它们可见的试样的各种特性。 一个主要的问题是该对象的特性将在的一组的情况下被转换成一个不同的强度。
样品的细节和边缘具有一个大小接近的成像光的波长将衍射或散射光，只要是在试样及其周围介质（环绕声）之间的折射率的差。 折射率被定义为速度的比通过空气或真空通过对象由光速除以点亮。 因为光穿过的任何材料的速度是小于光在真空中的速度，折射率总是超过用于与显微镜检查标本的1.0值。 为了解决物体之间的小的距离，并以再现它们的形状与合理的保真度，衍射光的大角度必须由显微镜物镜捕获。
通过物镜聚集衍射（或偏离）光必须进入在图像平面上的锐聚焦，以便产生样品详细地，如图3所示。在该图像平面上，包括所述衍射光的光波经受干扰与非衍射光。 光的干扰之后的能见度很大程度上取决于光照射样品的一致性，与能见度通过增加一致性比例增加。 在光学显微镜，聚光镜孔径光阑开口尺寸控制光射到试样上的空间相干性。 减小光圈开口尺寸产生更大的空间相干性。
显微镜长期以来依靠降低聚光镜孔径光阑开口尺寸增加阶段标本颗粒和边缘的度。 对比度为振幅对象也可以由聚光光圈的适当的调整提高。 不管它们是否属于一个幅度或相位标本小物体，边和颗粒将衍射光。 *衍射光的一部分被物镜（见图3）由于物镜的数值孔径限制捕获。 未收集剩余的衍射光表示丢失的图像信息。 用于聚光镜孔径光阑开口尺寸正确的设置是增强的标本图像对比度和引进衍射工件之间的折衷。 这些表现在分辨率，衍射环的叠加，并且在不在共同焦点检体从区域始发其它不希望的光学效果的损失。 由于衍射极限逼近，图像对比度变得更低为研究对象的细节变得越来越小，空间频率变大。
井上和弹簧所描述的图像对比度的比率标本对比度和在由实际和理想正弦图像时作为空间频率的函数作图的光学传递函数（otf）所占据的位置的相移。 在光从样本分布变得正弦情况下，该光学传递函数的模量变得调制传递函数（mtf）。 作为空间频率的增加，调制传递函数减小和标本的对比度降低。
对于每一个物镜，具体的调制传递函数是依赖于物镜的设计和数值孔径，对比度生成，照射光的波长的模式，和台下聚光镜的数值孔径。 物镜后侧焦点面的边缘充当用于衍射光的低通滤波器，其必须在图像平面被聚焦为发生并形成颗粒或边缘的图像的干扰。 在中间像平面聚焦显微镜带来这些衍射光波在一起。 的光的波前相对于所述检体的角度决定困难的在聚焦在光滑圆形表面，它通常不含有衍射点的顶部或底部的程度。 然而，球形标本或纤维的边缘容易集中，因为边缘接口是在足够的角向波前和衍射的光。
当讨论相位标本，我们将定义一个对象作为检体的任何解析部。 如图4所示。在该图中的许多对象将是平的或板状，该对象具有的厚度（t）和一个折射率，n(s)。 周围介质的折射率为n(m)。
光穿过与光路的检体，op = t（n(s)），并通过用光学路径周围介质，op = t（n(m)）。 的光程差（opd）可以表示为：
opd = (tn(s) - tn(m)) = t(n(s) - n(m))与相差之中：
δ = (2π/λ)(opd)其中π是一个常数（3.），λ是光照射在试样的波长。 光程差是两方面的产品：所述厚度（t）和在折射率（n）之差。 的opd常常可以是即使对象物的厚度是相当薄相当大。 另一方面，当样品的折射率和周围介质相同，则opd是零，即使试样的厚度是非常大的。 在这种情况下，光穿过对象行进仅仅延迟（相位差）相对于通过所述环绕的相等厚度的光。 相区别并不被人眼检测到。
在相差显微镜被设计为采取的检体，并在周围介质的对象之间的相位差的优势。 然而，这不是一个简单的相位差是必要的，但也从试样衍射必须发生在相差显微镜工作。
相位物体的见的形状是连续变化的光路或密度，如在图5中示出在这种情况下的半球形试样之一，相位物体的侧面可通过一个棱镜形状数学近似，如下面所讨论。 相位对象的图5中的折射率n（s）和周围介质的， 正（ 米 ）。 在形状自由基几何转变为相位物体在边缘a和b仅发生（见图5的（a））。 入射光撞击物体垂直于平面ab，而平面波阵面是平行于ab。
在1边界（图5中的圆形相对象的顶点（a））的基本平行于入射光波前而在a和b的边界是垂直的。 区2〜4是通过一个切线限定于相位物体的圆形表面（图5（b））的微型棱镜。 的“棱镜”的角度是在区域2比在区域4，它是相对的区域4'较小。 在边缘a和b的衍射是的。
因而，弯曲的对象是由许多棱镜和对象的相对侧的相反方向有取向棱晶。 陡的棱镜是在球形物体的赤道，同时与至少斜率棱镜位于顶部和底部。 这些微型棱镜组成的光学梯度：
og（光学梯度）=φ = α(n(s) - n(m))其中α是切线相对于平面波阵面的角度。 请注意，光学梯度是两个方面的产品：该光穿过侧之间的角度（α），并且在折射率差(n(s) - n(m))。 通过棱镜传递光通过所述角φ（见图5（c）和图5（d））的变化方向。 在方向上的变化可能是大的，即使在斜坡或边界梯度可能很小，如果在折射率的差大。 如果折射率相同，则光波穿过无折射的相位对象。 光出射棱镜的方向是依赖于相位物体（n（s））和其周围介质之间的折射率的相对差（n（ m ）;参见图5（c）和图5（d））。
正如我们上面所讨论的，圆润的阶段对象不断变化的光梯度，以及每一个人的光学梯度“棱镜”创建一个光偏转的角度不同。 图5（c）示出偏转方向，当周围介质的折射率比相位物体更大(n(m) > n(s))，和图5（d）示出的方向时则相反 (n(m) < n(s))。 偏转，φ，所述的角度是成正比的切线角度（α）和折射率差(n(s) - n(m))，使得：
tan φ = tan α (n(s) - n(m))对于小角度：
φ = α (n(s) - n(m))（弧度）到当相位物体的折射率超过周边介质的，关于该对象的每个斜率大小相等的梯度偏转以相同的角度概括光学梯度的边界，“棱镜”的效果。 此偏转角依赖于相对折射率差和几何切线角度（α）。 当介质(n(m)) 的折射率比所述对象 (n(s))的折射率越大，偏转距离时，情况正好相反的对面。 当没有梯度，有通过没有光偏转。
光可通过多种机制与样品相互作用以产生图像对比度。 这些包括从表面反射，吸收，折射，偏振，荧光和衍射。 相反，也可以通过照相或数字电子技术增加了显微镜的光学元件和照明模式的物理改性以及终图像的操纵。 下面的讨论突出了检体和光之间的各种相互作用和回顾一些已开发，以提高检体的对比光学显微技术。
当入射的光线照射的不透明表面，被反射的方式，是于该表面的地形。 非常光滑的表面在等于入射光，被称为镜面反射的机制的角度反射光。 不均匀或漫反射表面趋向于通过被称为漫反射现象的所有可能的角度反射光，从而导致进入物镜的光的量减少。 反射光显微镜对比度可通过仔细的样品制备得到增强。 金相样品常常蚀刻反应性液体和气体，以揭示晶粒边界和/或抛光以提高反射到显微镜的光的量。 渍，在荧光染料，薄膜，和金属涂层的形式，也可用于引入在反射光显微镜标本的对比度。 双折射标本可利用偏振光的反射光，透明的相位对象通常的观测使用诸如反射微分干涉对比，暗场照明，和霍夫曼调制对比受试者进行成像。
人眼对试样的幅度和波长的差异非常敏感。 出于这个原因，许多样品被切成非常薄的切片（从1-30微米厚），并用化学染料染色以提高对比度和居住标本内的结构之间进行区分。 这项技术已被用生物标本数百年来比较常用。 染料选择性地从一个或几个波长吸收光并且通过或反射所有其它波长。 一个例子是蓝色染料吸收所有可见光波长带的蓝色的例外，它是从反射并通过试样传播。 生物样品的内部结构元件通常染色用染料以选择性染色这些元素的混合物，增加其对材料的背景下，或者是透明的或染色的不同的颜色的对比。
这些技术也适用于荧光染料，其可用于增加在标本对比度具有高度特异性。 当荧光标本用可见光或近紫外光的一个波长的刺激，他们经常发光的波长更长，并由此成为可见的或相对于在现场或背景（图6）的其他对象对比。 荧光显微镜的技术中详细的显微镜底漆的另一部分进行讨论。
染色的标本的增加对比度的早期和目前使用的方法是利用色彩对比滤光片，雷登涂漆明胶平方（来自kodak），或干涉滤光器中的光路。 例如，如果检体与红染剂染色，绿色过滤器会变暗红色区域从而增加对比度。 另一方面，绿色过滤器将减轻任何绿色染色区域。 彩色滤光片是非常有价值的艾滋病标本的对比，尤其是当黑白显微摄影是我们的物镜。 绿色过滤器是用于消色差物镜，这是球绿光纠正，相差的物镜，这是专为波长假设使用的绿光操纵使用特别有价值，因为相标本通常是透明和缺乏固有的颜色。
各向异性材料通常表现出两个或更多的折射率，并因此被称为双折射，或双重折射。 其中包括在这一类中的样品是矿物质，晶体（其表现出高度的结构对称性的），纤维，毛发，和其它生物标本。 当光线进入一个非光学各向异性晶体的轴线（比光学轴以外的轴），其被折射到每个两条射线与以直角彼此面向其振动方向极化，并以不同的速度行进。 所得光波被极化，并在显微镜分析器重新组合以产生双折射的试样都高度着色和包含的对比度的显著量的图像时可产生干扰。
活标本和其他阶段的对象，这往往产生于明照明查看时较差的图像，是由光学，而不是下相差，霍夫曼调制对比度和微分干涉对比照明观察化学手段清晰可见。 这些技术需要在显微镜特殊的光学元件，但通常会产生足够的对比度的图像显示了有关试样结构的重要细节。 这些对比度增强技术的更深入的讨论可以在我们可以找到专门的显微镜技术部分。
用于对比度改进另一种简单的技术涉及的折射率从该样品的基本上不同的安装介质的选择。 例如，硅藻可以安装在各种对比增强介质，诸如空气或商业介质苏合香的。 在折射率差提高了这些无色对象的对比度，并使它们的轮廓和斑纹更可见。 以下部分描述了许多由现今显微镜用于提高标本的对比更复杂的技术。
对比增强技术 标本
类型 成像
技术
透射光
透明标本
相对象
细菌，精子，
在玻璃容器中的细胞，
原生动物，螨，纤维等 相差
微分干涉对比（dic）
霍夫曼调制对比
斜照明
光散射对象
硅藻，纤维，毛发，
淡水微生物，
放射虫，等等。 莱茵照明
暗场照明
相差和dic
光折射标本
胶体悬浮液
粉末和矿物质
液体 相差
分散染色
dic
振幅标本
染色组织
当然彩色标本
毛发和纤维
昆虫和海藻 明场照明
荧光样品
在组织培养细胞
荧光染色切片
涂片和价差 荧光照明
双折射标本
矿物薄切片
液晶
熔化和再结晶化学品
毛发和纤维
骨骼和羽毛 偏光照明
反射光
镜面（反射）表面
薄膜，反射镜
抛光金相试样
集成电路 明场照明
相差，dic
暗场照明
弥漫性（非反射）表面
薄和厚膜
岩石与矿物
毛发，纤维和骨
昆虫 明场照明
相衬，dic
暗场照明
振幅表面特征
染色纤维
弥漫金属标本
复合材料
聚合物 明场照明
暗场照明
双折射标本
矿物薄切片
毛发和纤维
骨骼和羽毛
单晶
定向膜 偏光照明
荧光样品
固定细胞
荧光染色切片
涂片和价差 荧光照明
表格1表1列出所选择的对比度增强技术（多个）的用于各种标本和材料进行了研究与两个发射和反射光显微术的摘要。 该表可被用作粗略的指导接近在光学显微镜特定成像问题。
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