实时荧光定量PCR（realtime PCR）
实验方法原理:
实时荧光定量pcr技术，是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
仪器、耗材:
离心管
离心机
风光光度计
电泳槽
凝胶板
realtime pcr仪
实验步骤:
一、 样品rna的抽提
1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其*溶解。
二、 rna质量检测
1. 紫外吸收法测定
先用稀释用的te溶液将分光光度计调零。然后取少量rna溶液用te稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定rna溶液 浓度和纯度。
(1)浓度测定
a260下读值为1表示40 ug rna/ml。样品rna浓度(μg/ml)计算公式为：a260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。具体计算如下：
rna溶于40 ul depc水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的te中，测得a260 = 0.21
rna 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul
取5 ul用来测量以后，剩余样品rna为35 ul，剩余rna总量为：
35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug
(2)纯度检测
rna溶液的a260/a280的比值即为rna纯度，比值范围1.8到2.1。
2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定
(1)制胶
三、样品cdna合成
四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量pcr
五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的dna模板
六、 待测样品的待测基因实时定量pcr
1. 所有cdna样品分别配置实时定量 pcr反应体系。
2. 体系配置如下：
序号 反应物 剂量
1 sybr green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1 ul
3 下游引物 1 ul
4 dntp 1 ul
5 taq聚合酶 2 ul
6 待测样品cdna 5 ul
7 ddh2o 30 ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
(3)将配制好的pcr反应溶液置于realtime pcr仪上进行pcr扩增反应。反应条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，后72℃7分钟延伸。
七、 实时定量pcr使用引物列表
引物设计软件：primer premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发dna 聚合反应(即错配)。
八、电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行realtime pcr反应。pcr产物与 dna ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，goldview染色，检测pcr产物是否为单一特异性扩增条带。
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(1)浓度测定
a260下读值为1表示40 ug rna/ml。样品rna浓度(μg/ml)计算公式为：a260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。具体计算如下：
rna溶于40 ul depc水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的te中，测得a260 = 0.21
rna 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul
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1. 所有cdna样品分别配置实时定量 pcr反应体系。
2. 体系配置如下：
序号 反应物 剂量
1 sybr green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1 ul
3 下游引物 1 ul
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5 taq聚合酶 2 ul
6 待测样品cdna 5 ul
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