细胞学堂 | 贴壁细胞6大培养难题原因和解决方法
贴壁细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。
贴壁细胞因其培养过程较为繁琐，所以培养时更容易出现问题。以下总结了贴壁细胞培养中常见的6种问题，并详细介绍原因和解决方法，若培养时遇到这些情况，可参考对应解决方法处理。
01
传代后细胞全部飘起
解决方法：检查所使用的培养基的颜色是否偏紫色（如图1），检查瓶盖是否透气，不透气瓶盖是否被拧松。
图1. 培养基颜色偏紫
通常培养基偏碱，颜色就会偏紫，主要是因为培养基里的酚红指示剂遇酸变黄、遇碱变紫，培养基量太少，或培养基存放时间太长时都会变碱。建议配好完-全培养基后分装到50ml离心管并于一周内用完，量少时放到15ml离心管里保存。
02
传代后部分细胞漂浮
原因及解决方法如下
1
传代前细胞密度太大：一般细胞汇合度达到80%时可进行传代操作，传代密度需适中，传代密度过高也会导致传代后漂浮；
2
细胞状态不好：可通过提高血清比例、稳定培养环境等方法进行改善；
3
吹打次数过多造成机械损伤：轻柔吹打，细胞呈单颗粒时可停止吹打，吹打过程避免气泡产生；
4
培养基更换后不适应：更换回原来的培养基；或者与原培养基比例混合后使用，使细胞有个适应期。
03
传代后细胞变形
原因及解决方法如下
1）变形，但细胞还在生长：可能是血清批次不一样导致，血清成分复杂，不同批次和品牌间均存在成分差异，影响细胞状态。建议使用同一批次血清，更换血清时需与原血清比例混合后使用，使细胞有过渡期；
2）变形，但细胞不长，且碎片增多：可能传代操作过程损伤，常见于消化不当，或者潜在支原体等污染导致细胞病态；消化时间根据每个细胞的状态来调整，消化过度或者消化不充分均会对细胞造成影响；培养过程应严格无菌操作，实验环境尽量洁净，确保细胞无外源污染。
04
细胞生长周期变慢，边养边漂
原因及解决方法如下
细胞传代时密度太稀或太密：建议细胞密度达80%左右进行传代，传代密度适中，密度过低会延长生长周期；
传代操作不当：根据细胞特性决定细胞消化时间，一般在显微镜下观察细胞回缩变圆并有少量细胞脱落即可终止消化，难消化的细胞可分次消化，每次时间不超过5min；频繁换液或者清洗细胞也会导致细胞状态变差，常规换液时间间隔为2~3天。
05
传代后细胞成团
解决方法如下
1
低密度接种，延长换液时间，防止细胞脱落；
2
使用多聚赖氨酸包被培养器皿，以增加细胞贴壁牢固度，降低细胞聚集成团的几率；
3
重新铺板，并更换新配制的培养基，加大血清比例（增加比例不超过5%）；
4
接种时，减少培养基量（如t25加3ml）以加快细胞贴壁速度，等待细胞贴壁后（约8-12小时），再补加培养基到正常用量。
06
细胞出现空泡
原因及解决方法如下
1）正常的细胞活动：有的细胞有正常的自噬行为或其他膜泡活动，无需特殊处理（如caco-2细胞）；
2）血清不适应、培养基成分改变、换液不及时等造成细胞营养不良：可通过更换更合适的血清或及时换液等方法解决；
3）机械损伤、ph偏高或偏低等造成细胞受损：注意培养条件及操作手法。
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01
传代后细胞全部飘起
解决方法：检查所使用的培养基的颜色是否偏紫色（如图1），检查瓶盖是否透气，不透气瓶盖是否被拧松。
图1. 培养基颜色偏紫
通常培养基偏碱，颜色就会偏紫，主要是因为培养基里的酚红指示剂遇酸变黄、遇碱变紫，培养基量太少，或培养基存放时间太长时都会变碱。建议配好完-全培养基后分装到50ml离心管并于一周内用完，量少时放到15ml离心管里保存。
02
传代后部分细胞漂浮
原因及解决方法如下
1
传代前细胞密度太大：一般细胞汇合度达到80%时可进行传代操作，传代密度需适中，传代密度过高也会导致传代后漂浮；
2
细胞状态不好：可通过提高血清比例、稳定培养环境等方法进行改善；
3
吹打次数过多造成机械损伤：轻柔吹打，细胞呈单颗粒时可停止吹打，吹打过程避免气泡产生；
4
培养基更换后不适应：更换回原来的培养基；或者与原培养基比例混合后使用，使细胞有个适应期。
03
传代后细胞变形
原因及解决方法如下
1）变形，但细胞还在生长：可能是血清批次不一样导致，血清成分复杂，不同批次和品牌间均存在成分差异，影响细胞状态。建议使用同一批次血清，更换血清时需与原血清比例混合后使用，使细胞有过渡期；
2）变形，但细胞不长，且碎片增多：可能传代操作过程损伤，常见于消化不当，或者潜在支原体等污染导致细胞病态；消化时间根据每个细胞的状态来调整，消化过度或者消化不充分均会对细胞造成影响；培养过程应严格无菌操作，实验环境尽量洁净，确保细胞无外源污染。
04
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原因及解决方法如下
细胞传代时密度太稀或太密：建议细胞密度达80%左右进行传代，传代密度适中，密度过低会延长生长周期；
传代操作不当：根据细胞特性决定细胞消化时间，一般在显微镜下观察细胞回缩变圆并有少量细胞脱落即可终止消化，难消化的细胞可分次消化，每次时间不超过5min；频繁换液或者清洗细胞也会导致细胞状态变差，常规换液时间间隔为2~3天。
05
传代后细胞成团
解决方法如下
1
低密度接种，延长换液时间，防止细胞脱落；
2
使用多聚赖氨酸包被培养器皿，以增加细胞贴壁牢固度，降低细胞聚集成团的几率；
3
重新铺板，并更换新配制的培养基，加大血清比例（增加比例不超过5%）；
4
接种时，减少培养基量（如t25加3ml）以加快细胞贴壁速度，等待细胞贴壁后（约8-12小时），再补加培养基到正常用量。
06
细胞出现空泡
原因及解决方法如下
1）正常的细胞活动：有的细胞有正常的自噬行为或其他膜泡活动，无需特殊处理（如caco-2细胞）；
2）血清不适应、培养基成分改变、换液不及时等造成细胞营养不良：可通过更换更合适的血清或及时换液等方法解决；
3）机械损伤、ph偏高或偏低等造成细胞受损：注意培养条件及操作手法。
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