哺乳动物贴壁细胞的培养
一．细胞贴壁的原理
细胞分泌一种胞膜外膜基质，这种细胞基质能黏附固定在被支持物上（如培养瓶、培养皿的底面）细胞的外表面。细胞主要通过表达其壁表面上的各种黏附的因子而与上述这些表面细胞及外源基质发生结合。所以一个细胞的能否紧贴其壁既与此细胞及其本身所分泌各种细胞或外来源基质分子的粘附能力高低及其细胞壁本身能够表达出的这些黏附分子的种类数量高低有关，也是与细胞培养用皿壁材料的特殊表面结构有关。
二．贴壁细胞的培养
1.细胞的复苏：（1）提前打开超净工作台紫外灭菌30 min；（2）提前打开水浴锅至37℃，预热所用培养基。（3）在液氮中取出冻存的细胞，以“慢冻速溶”的原则把细胞放入37℃水浴锅中，使细胞迅速融化，该过程在2 min内完成，以保持细胞的活力。细胞解冻后放在离心机中，1000 rpm离心3-5 min，离心结束小心弃上清，并用提前预热的培养基吹打混匀细胞，在转移至合适培养皿中，置于细胞培养箱培养即可。
2.贴壁细胞的传代：（1）传代前先在显微镜下观察细胞状态是否良好。（2）观察细胞的汇合度是否达到70%-90%，细胞汇合度太低或太高都不利于细胞生长。（3）在给细胞传代时，首先弃去培养基，用ph为7.4的无菌的磷酸缓冲盐溶液（pbs）清洗细胞2-3次，动作要轻柔防止细胞脱落。（4）清洗完细胞后加入终浓度为0.25%的胰蛋白酶消化液消化细胞，消化过程中把细胞放在显微镜下观察，知道细胞被消化成一个个单独的小圆球时加入培养基终止细胞消化（时间太长会影响细胞活性，时间太短会消化不完）。（5）消化下来的细胞吹打混匀后以1:3-5的比例分装到新的培养皿中再加入足量的培养基继续扩大培养。
3.贴壁细胞的冻存：（1）弃去培养基，用ph为7.4的无菌磷酸缓冲盐溶液（pbs）清洗细胞2-3次，动作要轻柔防止细胞脱落。（2）向清洗完的细胞中加入0.25%的胰蛋白酶消化液消化细胞，整个过程在显微镜下观察，直到细胞被消化成单独的小圆球时加入培养基终止细胞消化。（3）消化下来的细胞按一下比例放入冻存管中：60%的胎牛血清（fbs）＋30%细胞悬液＋10%二甲基亚砜（dmso）。（4）在冻存管中要标注好细胞的名称、冻存时间、代数等信息。先放入负八十度冰箱冷藏十二小时后再把细胞取出放入液氮中保存。
4.贴壁细胞的转染：（1）前一天先把细胞铺进细胞培养皿中，加入培养基培养24小时，使得细胞汇合度达到60%-80%。（2）转染前要把培养基换成没有双抗的培养基，以排除双抗对转染效率的影响。（3）去适量纯培养基用于稀释质粒和lipo3000转染试剂，再向稀释完毕的质粒中加入p3000，充分混匀。再将其加入至稀释过的lipo3000中，轻柔吹打混匀混合液，室温孵育20 min。孵育结束后把质粒-p3000-lipo3000混合液加入细胞培养皿中，轻轻混匀，放入细胞培养箱中继续培养6 h，再更换成带有双抗的培养基即可。
三．常用的贴壁细胞
细胞名称
cho-k1细胞
293细胞
vero细胞
形态
表皮细胞
上皮细胞
上皮细胞
培养基
ham's f12k（含 2 mm l - 谷氨酰胺，1.5 g/l nahco3）， 10% 胎牛血清
mem（含 2 mm l - 谷氨酰胺和 earle's bss，1.5 g/l nahco3, 0.1 mm 非必需氨基酸，1.0 mm 丙酮酸钠）， 10% 马血清（热灭活）
mem（含 2 mm l - 谷氨酰胺和 earle's bss，1.5 g/l nahco3, 0.1 mm 非必需氨基酸，1.0 mm 丙酮酸钠）， 10% 胎牛血清
传代
吸去培养液。 用 0.25% (w/v) trypsin- 0.53 mm edta 洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加 2 - 3 毫升 trypsin-edta，放在 37℃ 培养箱内约 5 分钟，直到细胞全部脱落。加 6 - 8 毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以 1：4 到 1：8 为宜，传代期间培养液更换 1 - 2 次）
吸去培养液。 用 0.25% (w/v) trypsin- 0.53 mm edta 洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加 2 - 3 毫升 trypsin-edta，放在 37℃ 培养箱内约 5 分钟，直到细胞全部脱落。加 6 - 8 毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以 1：2 到 1：4 为宜，传代期间培养液 2 - 3 天更换 1 次）
吸去培养液。 用 0.25% (w/v) trypsin- 0.53 mm edta 洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加 2 - 3 毫升 trypsin-edta，放在 37℃ 培养箱内约 5 分钟，直到细胞全部脱落。加 6 - 8 毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以 1:3 至 1:6 为宜，传代期间培养液每周更换 2 - 3 次）
冻存
95% 培养液 + 5% dmso 冻存于液氮
95% 培养液 + 5% dmso 冻存于液氮
95% 培养液 + 5% dmso 冻存于液氮
四．贴壁细胞培养的应用
1.细胞学研究：贴壁细胞培养可以为细胞学研究提供许多有用的信息，如细胞分裂、分化和转化等。
2.疾病模型：通过培养患者的贴壁细胞，建立起与某些疾病相关的细胞模型，如癌症等。
3.药物筛选：通过培养贴壁细胞测试药物的疗效和毒性，从而筛选出具有治疗潜力的药物。
4.基因编辑：为crispr-cas9基因编辑技术等提供重要支持。
五．贴壁细胞展示
封闭培养的细胞增殖缓慢，细胞折光性强，3%组在培养120 h后仍未能成片。
a：2%封闭组细胞；b：3%封闭组细胞；c：3%开放组细胞
图2 贴壁细胞展示
卡梅德技术和实验人员有多年的细胞培养经验，可进行细胞转染、增殖、凋亡、细胞共培养、细胞转株筛选等实验，制定细胞培养综合方案，为客户提供优质服务。
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二．贴壁细胞的培养
1.细胞的复苏：（1）提前打开超净工作台紫外灭菌30 min；（2）提前打开水浴锅至37℃，预热所用培养基。（3）在液氮中取出冻存的细胞，以“慢冻速溶”的原则把细胞放入37℃水浴锅中，使细胞迅速融化，该过程在2 min内完成，以保持细胞的活力。细胞解冻后放在离心机中，1000 rpm离心3-5 min，离心结束小心弃上清，并用提前预热的培养基吹打混匀细胞，在转移至合适培养皿中，置于细胞培养箱培养即可。
2.贴壁细胞的传代：（1）传代前先在显微镜下观察细胞状态是否良好。（2）观察细胞的汇合度是否达到70%-90%，细胞汇合度太低或太高都不利于细胞生长。（3）在给细胞传代时，首先弃去培养基，用ph为7.4的无菌的磷酸缓冲盐溶液（pbs）清洗细胞2-3次，动作要轻柔防止细胞脱落。（4）清洗完细胞后加入终浓度为0.25%的胰蛋白酶消化液消化细胞，消化过程中把细胞放在显微镜下观察，知道细胞被消化成一个个单独的小圆球时加入培养基终止细胞消化（时间太长会影响细胞活性，时间太短会消化不完）。（5）消化下来的细胞吹打混匀后以1:3-5的比例分装到新的培养皿中再加入足量的培养基继续扩大培养。
3.贴壁细胞的冻存：（1）弃去培养基，用ph为7.4的无菌磷酸缓冲盐溶液（pbs）清洗细胞2-3次，动作要轻柔防止细胞脱落。（2）向清洗完的细胞中加入0.25%的胰蛋白酶消化液消化细胞，整个过程在显微镜下观察，直到细胞被消化成单独的小圆球时加入培养基终止细胞消化。（3）消化下来的细胞按一下比例放入冻存管中：60%的胎牛血清（fbs）＋30%细胞悬液＋10%二甲基亚砜（dmso）。（4）在冻存管中要标注好细胞的名称、冻存时间、代数等信息。先放入负八十度冰箱冷藏十二小时后再把细胞取出放入液氮中保存。
4.贴壁细胞的转染：（1）前一天先把细胞铺进细胞培养皿中，加入培养基培养24小时，使得细胞汇合度达到60%-80%。（2）转染前要把培养基换成没有双抗的培养基，以排除双抗对转染效率的影响。（3）去适量纯培养基用于稀释质粒和lipo3000转染试剂，再向稀释完毕的质粒中加入p3000，充分混匀。再将其加入至稀释过的lipo3000中，轻柔吹打混匀混合液，室温孵育20 min。孵育结束后把质粒-p3000-lipo3000混合液加入细胞培养皿中，轻轻混匀，放入细胞培养箱中继续培养6 h，再更换成带有双抗的培养基即可。
三．常用的贴壁细胞
细胞名称
cho-k1细胞
293细胞
vero细胞
形态
表皮细胞
上皮细胞
上皮细胞
培养基
ham's f12k（含 2 mm l - 谷氨酰胺，1.5 g/l nahco3）， 10% 胎牛血清
mem（含 2 mm l - 谷氨酰胺和 earle's bss，1.5 g/l nahco3, 0.1 mm 非必需氨基酸，1.0 mm 丙酮酸钠）， 10% 马血清（热灭活）
mem（含 2 mm l - 谷氨酰胺和 earle's bss，1.5 g/l nahco3, 0.1 mm 非必需氨基酸，1.0 mm 丙酮酸钠）， 10% 胎牛血清
传代
吸去培养液。 用 0.25% (w/v) trypsin- 0.53 mm edta 洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加 2 - 3 毫升 trypsin-edta，放在 37℃ 培养箱内约 5 分钟，直到细胞全部脱落。加 6 - 8 毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以 1：4 到 1：8 为宜，传代期间培养液更换 1 - 2 次）
吸去培养液。 用 0.25% (w/v) trypsin- 0.53 mm edta 洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加 2 - 3 毫升 trypsin-edta，放在 37℃ 培养箱内约 5 分钟，直到细胞全部脱落。加 6 - 8 毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以 1：2 到 1：4 为宜，传代期间培养液 2 - 3 天更换 1 次）
吸去培养液。 用 0.25% (w/v) trypsin- 0.53 mm edta 洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加 2 - 3 毫升 trypsin-edta，放在 37℃ 培养箱内约 5 分钟，直到细胞全部脱落。加 6 - 8 毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以 1:3 至 1:6 为宜，传代期间培养液每周更换 2 - 3 次）
冻存
95% 培养液 + 5% dmso 冻存于液氮
95% 培养液 + 5% dmso 冻存于液氮
95% 培养液 + 5% dmso 冻存于液氮
四．贴壁细胞培养的应用
1.细胞学研究：贴壁细胞培养可以为细胞学研究提供许多有用的信息，如细胞分裂、分化和转化等。
2.疾病模型：通过培养患者的贴壁细胞，建立起与某些疾病相关的细胞模型，如癌症等。
3.药物筛选：通过培养贴壁细胞测试药物的疗效和毒性，从而筛选出具有治疗潜力的药物。
4.基因编辑：为crispr-cas9基因编辑技术等提供重要支持。
五．贴壁细胞展示
封闭培养的细胞增殖缓慢，细胞折光性强，3%组在培养120 h后仍未能成片。
a：2%封闭组细胞；b：3%封闭组细胞；c：3%开放组细胞
图2 贴壁细胞展示
卡梅德技术和实验人员有多年的细胞培养经验，可进行细胞转染、增殖、凋亡、细胞共培养、细胞转株筛选等实验，制定细胞培养综合方案，为客户提供优质服务。
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