荧光共振能量转移（FRET）显微镜
入门概念
活细胞中特定分子种类之间相互作用的精确位置和性质在生物学研究的许多领域中都引起了人们的极大兴趣，但是，由于用于检查这些现象的仪器的分辨率有限，因此研究常常受到阻碍。常规的宽视野荧光显微镜能够将荧光标记的分子定位在瑞利标准定义的光学空间分辨率范围内，大约200纳米(0.2微米)。但是，为了了解参与典型生物分子过程的蛋白质伴侣之间的物理相互作用，必须确定比衍射受限的传统光学成像方法所允许的分子的相对接近度。的技术当应用于光学显微镜时，荧光共振能量转移(通常缩写为fret)可以确定几纳米内两个分子之间的接近方式(见图1)，该距离足够近，可以发生分子相互作用。
典型的荧光显微镜技术依赖于荧光团在一个波长处的光吸收(激发)，随后在更长波长处随后发射次级荧光。激发和发射波长通常彼此分开数十到数百纳米。用特定的荧光团标记细胞核成分，例如细胞核，线粒体，细胞骨架，高尔基体和膜，可以使其在固定和活体制剂中定位。通过用具有分离的激发光谱和发射光谱的单个荧光团同时标记几个亚细胞结构，可以使用专门的荧光滤光片组合来检查单个细胞或组织切片中标记分子的接近程度。用这种技术 比光学分辨率极限更近的分子似乎是重合的，这种明显的空间接近性意味着分子缔合是可能的。然而，在大多数情况下，正常的衍射极限荧光显微镜分辨率不足以确定生物分子之间是否相互作用。荧光共振能量转移是这样一种过程，通过该过程，从激发态荧光团到紧邻的第二生色团发生*的能量转移。由于能量转移的范围限制为大约10纳米(100埃)，并且转移效率对荧光团之间的分离距离极为敏感，
荧光共振能量转移的机制涉及处于激发电子态的供体荧光团，其可能将其激发能转移至附近的受体通过长距离偶极-偶极相互作用以非辐射方式形成发色团。支持能量转移的理论基于将激发的荧光团视为振荡偶极子的概念，该振荡偶极子可以与具有相似谐振频率的第二偶极子进行能量交换。在这方面，共振能量的传递类似于耦合振荡器的行为，例如一对以相同频率振动的音叉。相比之下，辐射能转移需要光子的发射和重新吸收，并取决于样品的物理尺寸和光学特性，以及容器的几何形状和波前路径。与辐射机制不同，共振能量转移可以产生大量有关供体-受体对的结构信息。
共振能量转移对荧光团周围的溶剂壳不敏感，因此产生的分子信息与溶剂依赖性事件(例如荧光猝灭，激发态反应，溶剂弛豫或各向异性测量)所揭示的分子信息。对参与共振能量转移的荧光团的主要溶剂影响是对供体和受体的光谱性质的影响。非辐射能量转移发生在比短距离溶剂效应更长的距离上，并且位于相关荧光团之间的成分(溶剂和主体大分子)的介电性质对共振能量转移的功效影响很小，这主要取决于供体和受体荧光团之间的距离。
荧光共振能量转移现象不是由光子发射介导的，而且甚至不需要受体发色团发荧光。然而，在大多数应用中，供体和受体都是荧光的，能量转移的发生通过供体荧光的猝灭和荧光寿命的降低而显现出来，伴随着受体荧光发射的增加。能量转移过程的效率与分隔供体和受体分子的距离的倒数六次方成正比。因此，fret测量可以用作有效的分子标尺用于确定用适当的供体和受体荧光染料标记的生物分子之间的距离在10纳米之内的距离。
图1给出了连接到相同大分子蛋白质相对末端的两个荧光染料之间荧光共振能量转移的假设示例。在天然构象(图1(a))中，两个荧光团之间的距离大约为12纳米。 ，对于在荧光染料之间发生分子内共振能量转移来说太远了。但是，当蛋白质被诱导经历构象变化时(图1(b))，两种荧光染料之间的距离就更近了，它们现在可以参与fret分子的相互作用。在该图中，供体荧光色素的激发由黄色三核芳族分子周围的蓝色发光指示，而相应的受体发射(图1(b))则由蛋白质右侧第二个杂环荧光染料周围的绿色发光表示。能量转移测量通常用于估算大分子上位点之间的距离以及构象变化对这些距离的影响。在这种类型的实验中，能量转移的程度用于计算供体和受体之间的距离，并获得有关大分子的结构信息。
尽管荧光共振能量转移已经常用于研究蛋白质和脂质中的分子间和分子内结构和功能修饰，但在活细胞中实施fret显微镜技术的主要障碍是缺乏使用合适的荧光团标记特定细胞内蛋白的合适方法。水母绿色荧光蛋白(gfp)的克隆及其在多种细胞类型中的表达已成为开发在活细胞中进行基因表达和结构蛋白定位的标记的关键。已开发出该蛋白的几种光谱上不同的突变变体，包括发出蓝光的荧光蛋白(蓝色荧光蛋白，bfp)。天然gfp和bfp突变体的激发光谱和发射光谱在波长上都足够分开，以与fret方法兼容。图2说明了使用荧光共振能量转移和突变型荧光蛋白检测蛋白-蛋白相互作用的策略。如果两种蛋白质(一种被bfp标记(供体)，另一种被gfp标记(受体))发生物理相互作用，则当以大吸收波长激发复合物时，会观察到在大受体发射波长(510纳米)处强度增加。 (380纳米)的供体。蛋白质未能形成复合物导致没有受体(gfp)荧光发射。
加上脉冲激光，显微镜光学和基于计算机的成像技术的进步，供体和受体荧光团实际上是生物分子本身的一部分的标记技术的发展使活细胞内动态蛋白质相互作用的可视化成为可能。除了研究蛋白质伴侣之间的相互作用外，荧光共振能量转移的应用还包括蛋白酶活性研究，膜电压电位改变，钙代谢以及高通量筛选分析的开展，例如用于定量分析基因表达。单个活细胞。
荧光共振能量转移原理
共振能量转移(过程ret当电子激发态的供体荧光团将其激发能转移到附近的发色团(受体)时，可能会发生)。原则上，如果供体分子的荧光发射光谱与受体分子的吸收光谱重叠，并且两者在小空间半径内，则供体可以通过远距离偶极-偶极分子间分子将其激发能直接转移至受体。耦合。西奥多·福斯特(theodorförster)在1940年代后期提出的理论初描述了共振能量转移中涉及的分子相互作用，而福斯特(förster)还开发了形式方程式，定义了转移速率，生色团间距离和相关生色团的光谱性质之间的关系。
共振能量转移是一种*的量子机械过程，不需要碰撞并且不产生热量。发生能量转移时，受体分子会淬灭供体分子的荧光，如果受体本身是荧光色素，则会增加或敏化观察到荧光发射(见图3)。可以通过以下方式观察到该现象：用包含与供体荧光团的吸收大值相对应的波长的光激发包含供体和受体分子的样品，并检测以集中在受体的大发射附近的波长发射的光。迅速流行的另一种检测方法是在存在和不存在受体的情况下测量供体荧光团的荧光寿命。
图3所示的jablonski图说明了荧光共振能量转移中供体发射与受体吸收之间的耦合跃迁。吸收和发射跃迁由直的垂直箭头(分别为绿色和红色)表示，而振动松弛由波浪形的黄色箭头表示。耦合的跃迁用虚线绘制，表明如果它们是由光子介导的电子跃迁引起的，则表明它们在jablonski图中的正确位置。在合适的受体存在下，供体荧光团可以将激发态能量直接转移到受体上，而不会发射光子(如图3中的蓝色箭头所示)。所得的敏化的荧光发射具有类似于受体的发射光谱的特性。
为了使共振能量转移发生，必须满足几个标准。除了供体和受体分子的发射和吸收光谱重叠之外，两个涉及的荧光团必须位于彼此1到10纳米的范围内。如由förster推导的方程式所述(并在下文讨论)，供体分子和受体分子之间的能量转移效率随着两者之间距离的六次幂而降低。因此，供体荧光团通过非辐射相互作用将其激发能转移至受体的能力随着分子之间距离的增加而急剧下降，从而将fret现象限制在大约10纳米的大供体-受体分离半径处。在小于1纳米的距离处 能量和/或电子转移的其他几种模式也是可能的。共振能量转移过程的距离依赖性是其在研究分子相互作用中的主要基础。在涉及用供体和受体荧光团标记的分子的活细胞研究中，共振能量转移只会发生在足够接近以彼此发生生物学相互作用的分子之间。
共振能量转移的另一要求是供体分子的荧光寿命必须具有足够的持续时间以允许事件发生。在存在和不存在受体的情况下，能量转移的速率(k(t))和效率(e(t))都直接与供体荧光团的寿命相关。根据福斯特(förster)的理论并经过实验验证，能量传递的速率由以下公式给出：
kt = (1/τd) • [r0/r]6
其中r(0)是förster临界距离，τ(d)是在没有受体的情况下的供体寿命，而r是将供体和受体生色团分开的距离。förster临界距离(r(0))定义为受体与受体的分离半径，对于该半径，传输速率等于不存在受体时施主衰变(去激发)的速率。换句话说，当供体和受体半径(ř)等于förster距离，则传输效率为50%。在此分离半径下，一半的供体激发能通过共振能转移到受体，而另一半则通过所有其他可用过程的结合而耗散，包括荧光发射。
从概念上讲，förster临界距离是供体和受体分子之间的大分离长度，在该距离下仍将发生共振能量转移。临界距离值通常落在2至6纳米的范围内，这很幸运，约为许多蛋白质分子尺寸。另外，临界距离范围还对应于其他几个生物学上重要的尺寸，例如细胞膜厚度和具有多个亚基的蛋白质上的距离分离位点。r(0)的值(以纳米为单位)可以根据以下表达式计算：
r0 = 2.11 × 10-2 • [κ2 • j(λ) • η-4 • qd]1/6
其中κ平方是描述供体和受体跃迁偶极之间空间相对取向的因素，j(λ)是供体发射光谱和受体吸收光谱区域中的重叠积分(波长以纳米表示) )，η代表介质的折射率，而q(d)是施主的量子产率。
能量转移的效率e(t)是供体吸收的光子转移到受体的比例的度量，并且与供体-受体的分离距离r有关，公式如下：
r = r0 • [(1/et) - 1]1/6
和e(t)被评估为：
et = 1 - (τda/τd)
其中τ(da)是存在受体时的供体寿命，而τ(d)是存在受体时的供体寿命。因此，通过在存在和不存在受体的情况下测量供体荧光寿命(这表明由于受体导致的供体猝灭程度)，可以确定分离供体和受体分子的距离。在许多常用技术中，通过在存在和不存在受体的情况下对相对平均供体荧光强度进行稳态测量来确定能量转移效率(而不是通过测量寿命)。
总之，能量转移的速率取决于施主发射光谱和受主吸收光谱之间的光谱重叠程度(见图4)，施主的量子产率，施主和受主跃迁偶极矩的相对取向以及供体和受体分子之间的距离。影响施主与受主之间距离的事件或过程都将影响共振能量转移速率，因此，只要可以控制或消除伪影，就可以对现象进行量化。
比较它们作为荧光共振能量转移对的潜在应用时，图4给出了青色荧光蛋白(cfp，供体)和红色荧光蛋白(rfp或dsred，受体)的吸收和发射光谱。两种生物肽的吸收光谱显示为红色曲线，而发射光谱显示为蓝色曲线。供体发射光谱和受体吸收光谱之间的重叠区域由曲线底部附近的灰色区域表示。每当分子的光谱重叠增加得太远时，这种现象称为光谱渗出或交叉发生这样的情况：在受体发射通道中检测到来自受激受体的信号(来自施主的激发照明)和施主发射。结果是必须从弱受体荧光发射中提取高背景信号。
非辐射能量转移的基本理论直接适用于相隔固定距离的供体-受体对，在这种情况下，能量转移的速率是förster距离r(0)的函数，后者又取决于κ平方，j(λ)，η和q(d)。如果已知这些因素，则可以计算供体和受体之间的距离。需要使用更复杂的公式来描述多种受体生色团和距离分布等情况。表1列出了一系列实验测量的förster临界距离，这些距离是根据几种流行的供体-受体荧光团对的光谱重叠确定的。由于该变量包括供体量子产率和光谱重叠程度，这两者均取决于局部环境条件，因此应在与用于研究共振能量转移的实验条件相同的实验条件下确定福斯特距离值。
能量传递介质的折射率通常从溶剂组成中已知，或者可以针对特定的大分子进行估算，通常在水溶液中为1.4。通过与具有已知量子产率的标准荧光团比较来确定供体的量子产率。由于q(d)在r(0)的计算中显示为第六根，因此q(d)值的微小误差或不确定性不会对förster距离计算产生较大影响。同样由于第六根依赖，r(0)不受j(λ)变化的很大影响，但仍必须对每个供体-受体对评估重叠积分。通常，供体发射光谱和受体吸收光谱之间较高的重叠度会产生较大的förster临界距离值。
常见ret供体-受体对的förster临界距离
供体
受体
福斯特距离（nm）
tryptophan
dansyl
2.1
iaedans (1)
ddpm (2)
2.5 - 2.9
bfp
dsrfp
3.1 - 3.3
dansyl
fitc
3.3 - 4.1
dansyl
octadecylrhodamine
4.3
cfp
gfp
4.7 - 4.9
cf (3)
texas red
5.1
fluorescein
tetramethylrhodamine
4.9 - 5.5
cy3
cy5
>5.0
gfp
yfp
5.5 - 5.7
bodipy fl (4)
bodipy fl (4)
5.7
rhodamine 6g
malachite green
6.1
fitc
eosin thiosemicarbazide
6.1 - 6.4
b-phycoerythrin
cy5
7.2
cy5
cy5.5
>8.0
（1）5-（2-乙酰氨基氨基）氨基萘-1-磺酸
（2）n-（4-二甲基氨基-3,5-二硝基苯基）马来酰亚胺（3）羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（4）4,4-二氟-4- bora-3a，4a-diaza-s-indacene
表格1
在文献中已经广泛讨论了评估取向因子（κ平方）的不确定性，尽管有实验证据表明förster理论是有效的并且适用于距离测量，但该变量仍然存在一定争议。认识到förster距离通常是针对κ的假定值，这一点很重要-平方，通常为2/3（0.67）的动态平均值。该假定值是由于能量转移之前通过旋转扩散使供体和受体取向随机化而产生的。方向因子取决于施主发射偶极和受体吸收偶极在空间中的相对方向，范围可以从零到4。值1对应于平行的过渡偶极，而值4则由两个偶极子产生平行和共线。
由于与förster距离的第六次根关系，定向因子从1到4的变化只会使计算出的距离发生26％的变化，而当通常假定值为0.67时，大误差为35％。应用。如果偶极子彼此*垂直地定向，并且相应的κ平方值等于零，则会导致严重的潜在误差。已经采用了几种用于处理不确定性的技术，包括以下假设：存在静态取向范围，并且在荧光团的激发态寿命期间不会改变。测量供体和受体的荧光各向异性可以确定κ的极限平方变化。另外，利用具有低荧光偏振的荧光团（由于来自多个重叠跃迁的发射）减少了取向因子的不确定性。以这种方式限制κ-平方的可能值可将潜在的距离计算误差降低到大约10％。
在许多情况下，即使不是不可能，也很难确定方向系数，并且变量的确切值通常被认为是无法解决的问题。但是，一些证据表明该因素在共振能量转移计算中的重要性受到限制。使用共振能量转移光谱法和x射线衍射技术比较供体和受体的距离在很大程度上支持了该因子至少为小肽和蛋白质假设为0.67（由förster理论提出）的有效性。较大的蛋白质存在更多的不确定性。在供体和受体探针都可以自由地不受限制的各向同性运动的前提下，使用该值作为定向因子是有效的。
对于松散结合的荧光染料，单键周围的自由旋转运动应能够使用平均取向值，但通过多个连接位点结合的分子的不受限制的运动可能不会发生。另一方面，κ平方的零和4的极值要求供体和受体的荧光偏振*，这是不可能实现的条件。一些研究人员已经进行了统计计算，他们认为供体-受体分布距离及其方向决定了观察到的平均距离。只要观察到的距离存在一定的分布（并且不受施主和受主相对于r（0）太近的限制）），可以可靠地获得荧光团之间的平均距离，并评估由于取向因子而引起的不确定性。
定向因子（κ平方）对供体发射偶极子和受体吸收偶极子（图5中所示）的相对方向的依赖性由下式给出：
κ2 = (cos θt - 3cos θdcos θa)2
= (sin θd sin θacos φ - 2cos θdcos θa)2
其中θ（t）是施主的发射跃迁偶极与受体的吸收跃迁偶极之间的夹角，θ（d）和θ（a）是这些偶极与连接施主和受体的矢量之间的夹角，以及φ是包含两个过渡偶极子的平面之间的角度。
当供体与受体的间隔长度接近两个分子的förster距离（r（0））时，能量转移效率对距离变化敏感。图6示出了转移效率与分离供体和受体的距离之间的指数关系。当分离距离减小到r（0）以下时，效率迅速提高到100％，反之，当r大于r（0）时效率下降到零。由于传输效率对距离有很强的依赖性（六次方），因此仅当施主和受主半径位于förster距离内两倍时，才能可靠地测量施主与受主的分离距离。当r大约为r（0）的 50％时，共振能量转移效率接近大值，因此无法可靠地确定较短的距离。当施主-受主距离超过r（0）值50％时，曲线的斜率非常浅，无法解决更长的分离距离。
知道临界förster距离的实际意义在于，该值可为分离距离范围提供指南，该距离可由fret确定，用于给定的一对探针（请参见表1）。因为当供体-受体距离接近förster距离时，能量转移测量对距离变化非常敏感，因此目标分子相互作用的近似尺寸是选择荧光染料对时重要的因素。根据是否要进行稳态或时间分辨测量，应考虑的其他因素包括化学稳定性，量子产率和荧光团衰变寿命。由于不存在用于普通荧光共振能量转移技术的内部距离参考，
通过福斯特机理进行的共振能量转移现象在某些方面是复杂的，但在其产生的效果上却是简单且可靠的。从供体和受体的光谱性质可以准确地预测福斯特距离，并且由于尚未发现该理论的例外情况，因此可以假设在任何将供体-受体分子对紧密靠近的条件下发生共振能量转移。描述偶极转移的理论之所以复杂，不是因为转移机制本身，而是因为距离分布（包括非随机分布）的出现以及供体和受体分子的扩散。当采取步骤对一系列几何形状和时间范围内能量转移的距离依赖性求平均时
fret技术在光学显微镜中的应用
用于荧光共振能量转移研究的显微镜配置参数随荧光团，标本和成像模式的要求而变化，但是实际上任何立式或倒置显微镜都可以改装为fret显微镜（参见图7）。通常，显微镜应配备高分辨率（12位）冷却和增强型ccd摄像头系统，该系统应与高质量的干涉滤光片相连，该滤光片具有较低的串扰水平（小阻断水平）和与荧光光谱非常接近的带通区域。检测器的灵敏度决定了滤波器的通带宽度有多窄，并且仍使数据采集能够以可接受的速度进行，同时光谱泄漏噪声小。在多数情况下，
宽视场荧光显微镜的荧光团发射源于焦平面的上方和下方，从而产生具有明显失焦信号的图像，从而降低对比度并导致图像质量下降。由于共振能量转移会产生固有的低信号水平，因此在fret显微镜中使这个问题更加复杂。为了减少或消除远离焦平面的信号，可以将数字解卷积技术耦合到光学切片中，但是该过程的计算量很大，并且对于许多动态fret成像实验而言可能不够快。激光扫描共聚焦技术可应用于fret显微镜，以显着提高横向分辨率，同时能够以接近实时的间隔收集串行光学切片。共聚焦显微镜的主要缺点是激发波长仅限于可用于特定系统的标准激光线，这限制了共振能量转移实验中荧光团供体和受体对的选择。多光子激发也可以与fret技术结合使用，并且由于涉及更长的激发波长，因此对细胞的损害较小。另外，在多光子激发的受限激发体积特征内，自发荧光伪影和样品的光漂白不太可能发生。多光子激发也可以与fret技术结合使用，并且由于涉及更长的激发波长，因此对细胞的损害较小。另外，在多光子激发的受限激发体积特征内，自发荧光伪影和样品的光漂白不太可能发生。多光子激发也可以与fret技术结合使用，并且由于涉及更长的激发波长，因此对细胞的损害较小。另外，在多光子激发的受限激发体积特征内，自发荧光伪影和样品的光漂白不太可能发生。
图7显示了一种典型的显微镜结构，该结构能够观察带有几个荧光共振能量转移成像图案的培养物中的活细胞。倒置组织培养显微镜的柱子上装有标准的钨卤素灯箱，以便检查和记录细胞使用标准明场，相位对比或微分干涉对比（dic）照明。注意，后两种对比度增强技术可以与荧光结合使用，以揭示荧光团在细胞结构内的空间位置。标准的珀耳帖冷却的ccd相机系统连接到显微镜三目镜头，用于广域荧光和明场图像捕获。
使用宽场照明（汞灯）或配备有高速nipkow磁盘系统的实时扫描共聚焦附件，使用图7中所示的多光谱显微镜进行共振能量转移实验。氩-激光束首先通过声光可调波长设备进行过滤，以选择特定的激发波长，然后再进入共聚焦扫描头。使用两台高分辨率的第三代增强型冷却ccd相机（分别读取单独的通道）将图像收集起来，然后将其后台打印到主机上。沿横向（x和y）和轴向（z）平面可收集光学部分以进行三维图像重建。多种图像处理软件程序与所示的显微镜配置兼容。
根据现象的基本原理，在使用光学显微镜进行荧光共振能量转移测量时，应考虑许多重要的实践要点：
供体和受体荧光团的浓度必须严格控制。当许多受体分子围绕单个供体分子时，发生达到荧光共振能量转移的统计学概率。
必须消除光漂白，因为伪影会改变施主与受主的分子比率，从而改变共振能量转移过程的测量值。
供体荧光发射光谱和受体吸收光谱应具有基本重叠的区域。
在用于激发供体的波长范围内，受体的直接激发应小。稳态fret显微镜测量中常见的误差来源是使用受体滤光片组检测供体发射。
供体和受体的发射波长必须与检测器的大灵敏度范围一致。
供体的吸收和发射光谱应具有小的重叠，以减少供体之间的自转移的可能性。
供体分子必须是荧光的并且具有足够长的寿命，以便发生共振能量转移。
供体应表现出低极化各向异性，以减少取向（κ平方）因子值的不确定性。捐助者满足了这一要求，这些捐助者的发射是由几个重叠的激发跃迁引起的。
使用抗体标记技术时，与供体和受体荧光染料偶联的试剂的生物学活性不应改变。活性的任何降低都会严重影响所得共振能量转移测量的有效性。
因为荧光共振能量转移要求供体和受体分子具有适当的偶极排列，并且彼此之间位于10纳米之内，所以必须考虑与分子连接的试剂的三级结构。例如，当供体-受体分子可以连接到蛋白质上的不同结构位置（例如羧基或氨基末端）时，即使蛋白质相互作用，也可能不会观察到fret，因为供体和受体分子位于相互作用分子的相对端。
应当使用传统的免疫组织化学技术对标记有绿色荧光蛋白突变体以进行fret研究的活细胞进行分析，以验证标记的蛋白具有与天然蛋白相同的细胞内生境和特性。
为了使荧光共振能量转移现象提供有意义的数据作为光学显微镜中的工具，必须同时优化样品制备和成像参数。合适的供体和受体探针的选择以及它们用作分子标记的方式是一个重大挑战。另外，一旦阐明了允许能量转移的标记策略，便可以使用各种各样的技术本身来进行测量。大多数定量荧光显微镜检查是通过测量荧光发射强度进行的。基于荧光强度的fret检测通常是通过监测与供体和受体生色团相对应的两个波长处发射强度的相对量的变化来实现的。i（a））伴随着供体发射强度（i（d））的降低。
尽管可以将供体或受体相对发射强度的变化视为共振能量转移的指示，但通常的方法是利用两个值的比率i（a）/ i（d），以衡量fret。该比率的值取决于施主-受主对之间的平均距离，并且对激发光束进入的路径长度和体积的差异不敏感。任何引起分子对之间相对距离变化的样品条件都会改变供体和受体发射比。因此，可以通过优先激发供体荧光团并检测相互作用的受体荧光团的发射增加来检测显微镜下的fret，伴随着由于能量转移而猝灭产生的供体荧光减少。使用强度监测方法测量fret被称为稳态荧光共振能量转移成像。
根据它们的吸收和发射光谱特征选择合适的供体和受体探针。为了获得大的共振能量转移，供体的发射光谱应与受体的吸收光谱基本重叠。另外，在给体的激发大值处，受体荧光团的直接激发应该小，并且在发生受体发射的波长区域中，在给体和受体之间不应有明显的发射重叠。在实践中，可能难以确定满足这些要求的供体-受体对。市售的荧光滤光片套件无法*有效地仅通过所需的波长，因此情况通常会变得复杂。设计通带之外的一小部分光可能会被传输。除非使用非常好的表征和受控的表达系统，否则可能难以确定供体和受体荧光团的精确浓度。自发荧光，光致漂白和背景荧光也可能需要进行其他校正。
图8展示了活细胞培养物中细胞内蛋白质-蛋白质结合的典型研究，研究了与细胞凋亡相关的事件，细胞凋亡是由一系列复杂的顺序相互作用导致的细胞死亡的生理过程。可以通过与荧光蛋白家族的适当成员（在这种情况下，bfp和gfp）融合来标记直接参与事件链的基因产物，以便在同一细胞中共表达，从而通过fret探测特异性结合。随着程序性细胞死亡的进行，参与凋亡的蛋白质在线粒体内相互作用并显示出结合的逐渐减少。因此，供体发射的图像（图8（a））仅包含bfp标记的蛋白质的荧光，而相应的受体发射曲线（图9（b））则说明了被gfp标记的蛋白质（以及供体发射的某些贡献）引起的信号。如下所述，fret滤光片（图8（c））揭示了源自两种蛋白质之间共振能量转移的荧光
通常，可能会影响荧光共振能量转移测量准确性的因素中，有几个对光学显微镜具有高度特异性。显微镜研究的主要目标是获得高分辨率图像，这需要特别注意用于光谱区分供体和受体的吸收和发射波长的光学滤光片的质量和性能。为了地提高信噪比（不对样品或所研究的过程造成不利影响），有必要在激发光照射的强度和时间与供体和受体荧光团以及检测器的浓度之间取得平衡。效率。如果供体-受体荧光团的浓度过高，可能会发生自我猝灭，从而影响fret测量的准确性。光漂白是所有荧光团的问题，会影响供体与受体的比例，从而改变荧光测量结果。过度的照明强度也会损坏标本，尤其是那些含有活细胞或组织的标本。
一种称为供体光漂白荧光共振能量转移（pbfret）的技术，它利用光漂白过程来测量fret，通常用于固定标本的研究中。基于逐个像素的分析，该方法已应用于测量荧光团偶联的单克隆抗体标记的细胞表面蛋白之间的邻近关系。光漂白fret基于以下理论：荧光团仅在升高到激发态时才对光损伤敏感。从统计上讲，任何时候只有一小部分分子处于激发态，因此，具有更长荧光寿命的荧光团遭受光损伤的可能性更高，并且呈现出更高的光漂白率。
支持该概念的实验证据表明，荧光团的光漂白时间与其激发态寿命成反比。共振能量转移的发生降低了供体分子的荧光寿命，有效地保护了其免于光致漂白。pbfret的计算基于相对于在没有共振能量转移的情况下测得的供体光漂白率的降低。fret研究中光漂白的测量需要相对较长的时间，因此于时间数据不重要且光漂白对细胞功能的影响不是问题的固定细胞标本。在某些方面，施主光漂白技术不如敏化发射测量复杂，
能量转移效率也可以通过受体光漂白技术来确定，其中通过比较选择性光漂白受体分子之前和之后的值来测量供体发射猝灭的变化。在去除受体之前和之后，分析相同样品区域中供体荧光强度的变化，具有仅需准备单个样品的优点，并将能量转移效率直接与供体和受体荧光相关。
在显微镜中准确测量荧光共振能量转移需要补偿所有潜在的误差源。已经开发出一种简单的技术来校正利用受体发射滤光片检测供体荧光和利用施主发射滤光片检测受体荧光（由于交叉或光谱渗漏）。该方法还校正了fret对供体和受体荧光团浓度的依赖性。需要少光谱信息的测量策略利用了三个滤波器组的组合，可以很容易地实现。供体，fret和受体滤光片组设计用于隔离和大化三个特定信号：供体荧光，归因于fret的受体荧光和直接激发的受体荧光，分别。在实践中，分别使用三个过滤器组检查了三个仅包含供体，正受体以及供体和受体的不同样品，并对所得数据进行了算术运算以校正交叉和供体-受体浓度的不受控制的变化。
图9所示为交叉（频谱渗漏）和滤波器串扰的示意图，这是要在荧光共振能量转移实验中获得定量结果必须克服的两个重要问题。交叉或渗漏通过供体荧光发射光谱与图9中受体发射干扰滤光片的带通区域的重叠来体现，导致供体发射信号（不需要的波长）通过发射滤光片传输。相比之下，滤波器串扰描述了串联在一起放置的两个滤波器在特定范围内的小衰减（阻塞）水平，并且在为荧光组匹配激发和发射滤波器时要引起关注。双色镜通常包含在荧光滤光片组合的串扰评估中。尽管很少将两个发射滤光片同时放置在光路中，但在图9中将光谱绘制在一起以同时说明两个概念。请注意，两个滤光片光谱（蓝色和红色曲线）代表干涉滤光片的透光率，而施主发射曲线（绿色）是强度与波长的关系图。
当采用稳态fret测量技术时，可能会引入重大错误的其他因素也需要进行校正。此外，需要仔细控制供体和受体荧光团的浓度。通过时间分辨，可以部分避免荧光团浓度的测定荧光测量，可提供一种无需精确了解供体浓度即可获得平均寿命的方法。该技术能够定量确定供体-受体间隔距离，并且基于在存在和不存在受体的情况下对供体寿命的测量。通过测量荧光强度随时间的变化，可以阐明激发态分子的发射动态，因此，可以获得有关供体-受体相互作用性质的更详细的信息。强度衰减的图形表示了荧光衰减过程的时间平均细节（请参见图10（a）），在采用稳态技术时无法解决。表示平均寿命相同值的测量值，
荧光团的荧光寿命（τ）是分子返回基态之前处于激发态的特征时间。代表在短暂激发光脉冲之后简化的单指数形式的荧光衰减，荧光强度随时间（t）的变化由以下公式给出：
i(t) = i0 exp (-t/τ)
其中i（0）是紧接激发光脉冲之后的初始荧光发射强度，i（t）是在时间t测量的荧光强度。荧光寿命（τ）定义为强度衰减到其初始值的1 / e（大约是i（0）的 37％；图10（a））所需的时间，并且是速率常数的倒数从激发态到基态的荧光衰减。
时间分辨与稳态fret测量的主要整体优势在于，可以以更高的定量精度绘制供体-受体间隔距离。这部分地是因为荧光寿命不取决于局部强度或浓度，并且很大程度上不受荧光团的光漂白的影响。然而，荧光寿命对荧光团环境高度敏感，即使具有相似光谱的分子在不同环境条件下也可能显示出不同的寿命。因为散射不会影响荧光团的寿命，所以寿命变化的测量可以提供与局部分子过程特别相关的信息。
荧光团的寿命会受到局部微环境中众多变量的影响，包括诸如疏水性，氧浓度，其他介质成分的离子强度，与大分子的结合以及与受体分子的接近度等因素，这些因素会耗尽激发态。共振能量转移。寿命测量可以作为分子相互作用的指标，并且与荧光团浓度无关，这是一个重要的实践优势。
通常用于测量荧光寿命的两种通用技术分为时域（脉冲的，见图10（a））和频域（也称为相位分辨的）。; 图10（b））方法。时域寿命测量使用脉冲激发光源，并且荧光寿命是通过直接测量发射信号或通过光子计数检测获得的。频域方法利用激发光源的正弦调制（从脉冲或调制激光系统获得），并根据荧光发射信号的相移和解调深度确定寿命。这些荧光寿命成像方法中的每一种都有特定的优点和缺点，并且都已广泛应用于常规的宽视野，共聚焦和多光子显微镜。
图10中示出了表示用于确定荧光寿命的时域和频域技术的示意图。在时域方法中（图10（a）），样品被短暂的激光脉冲激发，该脉冲的持续时间比被激发物质的寿命短得多，并且指数衰减曲线是随时间变化的。荧光衰减通常是单个荧光团的单指数函数，但是如果激发态在环境中具有许多可用的弛豫途径，则荧光衰减可以显示出更为复杂的特性。在频域实验中，来自与声光调制器耦合的连续波激光器的正弦调制光用于激发荧光团（图10（b））。产生的荧光发射以与激发相同的频率进行正弦调制，但伴随有相移和调制深度的减小。在单指数衰减的情况下，可以通过确定相移程度（φ或调制比（m），使用图10（b）中所示的公式。如果两个值相同，则荧光衰减实际上由单个指数函数组成。如果存在多个荧光物质（或单个荧光团遇到复杂的环境），则应在很宽的频率范围内评估相移和调制寿命。
测量荧光寿命的时域技术基本上依赖于单光子计数，并且需要具有足够时间分辨率的检测系统来收集每个激发脉冲产生的近100％的光子。尽管相位分辨技术对执行的要求相对较低，但它们通常不如光子计数方法那么灵敏。当采用相位调制来解决复杂的多荧光团寿命时，对于某些标本来说，长时间暴露于破坏性激发照明下可能证明是多余的，并且可能无法为活细胞过程提供足够的时间分辨率。技术取决于调查所需的信息和所研究样本的类型。
荧光寿命测量已被证明是fret的敏感指标，并且由于其寿命测量不受浓度（例如浓度和光程长度）等因素的影响，因而在活细胞研究中具有特殊优势，而这些因素在活体样本中难以控制。通过荧光寿命测量进行fret研究的主要优势在于，即使在具有相似发射光谱的供体-受体对之间也可以区分能量转移。当直接测量荧光寿命（与使用稳态值相反）时，无需对施主或受主荧光团进行光致破坏即可测定fret。由于fret通过能量转移到受体而缩短了供体分子的荧光寿命，τ（da））到不存在受体（τ（d））的情况下，就可以为每个图像像素计算fret效率值（e（t））。
根据技术的不同，荧光寿命的测量需要将样品暴露于激发光的高频重复脉冲或连续正弦调制光下。在活细胞研究中，必须始终评估高强度照明的效果。无论采用哪种方法，必须在与供体-受体测量相同的实验条件下确定不具有供体的供体的参考寿命。用单个样品完成此操作的一种方法是，在能量转移实验之后，测量光漂白破坏受体后的仅供体寿命。
结论
在生物学研究中，荧光共振能量转移的见应用是测量大分子（通常是蛋白质或核酸）上两个位点之间的距离或检查生物分子实体之间的体内相互作用。蛋白质可以用合成荧光染料或免疫荧光团标记，以充当供体和受体，但是荧光蛋白遗传学的进展现在使研究人员能够使用具有不同光谱特征的多种生物荧光团来标记特定的靶蛋白。在许多情况下，氨基酸*被用作内在的供体荧光团，其可以与用作受体的任意数量的外在探针偶联。
如果大分子用单个供体和受体标记，并且在供体激发态寿命期间两个荧光染料之间的距离没有改变，那么可以通过稳态测量从能量转移的效率来确定探针之间的距离，以上。在供体和受体之间的距离围绕分布曲线波动的情况下，例如蛋白质装配体，膜，单链核酸或未折叠的蛋白质（请参见图11中所示的场景），仍然可以使用fret来研究现象，但时间分辨寿命测量是。图11说明了两种情况下的几种生物学应用，包括构象变化，解离或水解，膜状脂质囊泡融合，
尽管有各种方法可用于测量光学显微镜中的荧光共振能量转移，但没有一种方法**。有些技术需要更复杂和昂贵的仪器，而另一些则基于必须仔细验证的假设。某些方法适用于固定样本，但不能应用于活细胞系统，而其他方法则必须包含大量的校正计算或数据分析算法。但是，可以肯定的是，fret分析显示了在生物学应用的实用性和范围上进一步发展的巨大希望。近年来，仪器仪表已取得了巨大的进步，特别是在时间分辨技术方面。
成熟的皮秒和纳秒技术现在可以帮助完成过去仅很难完成的荧光寿命测量。荧光探针开发的进步产生了更小，更稳定的分子，并具有与生物靶标结合的新机制。也已经开发出具有广泛的固有激发态寿命的荧光团，并且正致力于开发荧光蛋白的遗传变异中更大的多样性。全新的荧光材料类别，其中许多比以前的荧光团小，并且可以在较低的分离距离下评估分子相互作用，有望提高标记的多功能性，并导致fret技术的新应用。
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活细胞中特定分子种类之间相互作用的精确位置和性质在生物学研究的许多领域中都引起了人们的极大兴趣，但是，由于用于检查这些现象的仪器的分辨率有限，因此研究常常受到阻碍。常规的宽视野荧光显微镜能够将荧光标记的分子定位在瑞利标准定义的光学空间分辨率范围内，大约200纳米(0.2微米)。但是，为了了解参与典型生物分子过程的蛋白质伴侣之间的物理相互作用，必须确定比衍射受限的传统光学成像方法所允许的分子的相对接近度。的技术当应用于光学显微镜时，荧光共振能量转移(通常缩写为fret)可以确定几纳米内两个分子之间的接近方式(见图1)，该距离足够近，可以发生分子相互作用。
典型的荧光显微镜技术依赖于荧光团在一个波长处的光吸收(激发)，随后在更长波长处随后发射次级荧光。激发和发射波长通常彼此分开数十到数百纳米。用特定的荧光团标记细胞核成分，例如细胞核，线粒体，细胞骨架，高尔基体和膜，可以使其在固定和活体制剂中定位。通过用具有分离的激发光谱和发射光谱的单个荧光团同时标记几个亚细胞结构，可以使用专门的荧光滤光片组合来检查单个细胞或组织切片中标记分子的接近程度。用这种技术 比光学分辨率极限更近的分子似乎是重合的，这种明显的空间接近性意味着分子缔合是可能的。然而，在大多数情况下，正常的衍射极限荧光显微镜分辨率不足以确定生物分子之间是否相互作用。荧光共振能量转移是这样一种过程，通过该过程，从激发态荧光团到紧邻的第二生色团发生*的能量转移。由于能量转移的范围限制为大约10纳米(100埃)，并且转移效率对荧光团之间的分离距离极为敏感，
荧光共振能量转移的机制涉及处于激发电子态的供体荧光团，其可能将其激发能转移至附近的受体通过长距离偶极-偶极相互作用以非辐射方式形成发色团。支持能量转移的理论基于将激发的荧光团视为振荡偶极子的概念，该振荡偶极子可以与具有相似谐振频率的第二偶极子进行能量交换。在这方面，共振能量的传递类似于耦合振荡器的行为，例如一对以相同频率振动的音叉。相比之下，辐射能转移需要光子的发射和重新吸收，并取决于样品的物理尺寸和光学特性，以及容器的几何形状和波前路径。与辐射机制不同，共振能量转移可以产生大量有关供体-受体对的结构信息。
共振能量转移对荧光团周围的溶剂壳不敏感，因此产生的分子信息与溶剂依赖性事件(例如荧光猝灭，激发态反应，溶剂弛豫或各向异性测量)所揭示的分子信息。对参与共振能量转移的荧光团的主要溶剂影响是对供体和受体的光谱性质的影响。非辐射能量转移发生在比短距离溶剂效应更长的距离上，并且位于相关荧光团之间的成分(溶剂和主体大分子)的介电性质对共振能量转移的功效影响很小，这主要取决于供体和受体荧光团之间的距离。
荧光共振能量转移现象不是由光子发射介导的，而且甚至不需要受体发色团发荧光。然而，在大多数应用中，供体和受体都是荧光的，能量转移的发生通过供体荧光的猝灭和荧光寿命的降低而显现出来，伴随着受体荧光发射的增加。能量转移过程的效率与分隔供体和受体分子的距离的倒数六次方成正比。因此，fret测量可以用作有效的分子标尺用于确定用适当的供体和受体荧光染料标记的生物分子之间的距离在10纳米之内的距离。
图1给出了连接到相同大分子蛋白质相对末端的两个荧光染料之间荧光共振能量转移的假设示例。在天然构象(图1(a))中，两个荧光团之间的距离大约为12纳米。 ，对于在荧光染料之间发生分子内共振能量转移来说太远了。但是，当蛋白质被诱导经历构象变化时(图1(b))，两种荧光染料之间的距离就更近了，它们现在可以参与fret分子的相互作用。在该图中，供体荧光色素的激发由黄色三核芳族分子周围的蓝色发光指示，而相应的受体发射(图1(b))则由蛋白质右侧第二个杂环荧光染料周围的绿色发光表示。能量转移测量通常用于估算大分子上位点之间的距离以及构象变化对这些距离的影响。在这种类型的实验中，能量转移的程度用于计算供体和受体之间的距离，并获得有关大分子的结构信息。
尽管荧光共振能量转移已经常用于研究蛋白质和脂质中的分子间和分子内结构和功能修饰，但在活细胞中实施fret显微镜技术的主要障碍是缺乏使用合适的荧光团标记特定细胞内蛋白的合适方法。水母绿色荧光蛋白(gfp)的克隆及其在多种细胞类型中的表达已成为开发在活细胞中进行基因表达和结构蛋白定位的标记的关键。已开发出该蛋白的几种光谱上不同的突变变体，包括发出蓝光的荧光蛋白(蓝色荧光蛋白，bfp)。天然gfp和bfp突变体的激发光谱和发射光谱在波长上都足够分开，以与fret方法兼容。图2说明了使用荧光共振能量转移和突变型荧光蛋白检测蛋白-蛋白相互作用的策略。如果两种蛋白质(一种被bfp标记(供体)，另一种被gfp标记(受体))发生物理相互作用，则当以大吸收波长激发复合物时，会观察到在大受体发射波长(510纳米)处强度增加。 (380纳米)的供体。蛋白质未能形成复合物导致没有受体(gfp)荧光发射。
加上脉冲激光，显微镜光学和基于计算机的成像技术的进步，供体和受体荧光团实际上是生物分子本身的一部分的标记技术的发展使活细胞内动态蛋白质相互作用的可视化成为可能。除了研究蛋白质伴侣之间的相互作用外，荧光共振能量转移的应用还包括蛋白酶活性研究，膜电压电位改变，钙代谢以及高通量筛选分析的开展，例如用于定量分析基因表达。单个活细胞。
荧光共振能量转移原理
共振能量转移(过程ret当电子激发态的供体荧光团将其激发能转移到附近的发色团(受体)时，可能会发生)。原则上，如果供体分子的荧光发射光谱与受体分子的吸收光谱重叠，并且两者在小空间半径内，则供体可以通过远距离偶极-偶极分子间分子将其激发能直接转移至受体。耦合。西奥多·福斯特(theodorförster)在1940年代后期提出的理论初描述了共振能量转移中涉及的分子相互作用，而福斯特(förster)还开发了形式方程式，定义了转移速率，生色团间距离和相关生色团的光谱性质之间的关系。
共振能量转移是一种*的量子机械过程，不需要碰撞并且不产生热量。发生能量转移时，受体分子会淬灭供体分子的荧光，如果受体本身是荧光色素，则会增加或敏化观察到荧光发射(见图3)。可以通过以下方式观察到该现象：用包含与供体荧光团的吸收大值相对应的波长的光激发包含供体和受体分子的样品，并检测以集中在受体的大发射附近的波长发射的光。迅速流行的另一种检测方法是在存在和不存在受体的情况下测量供体荧光团的荧光寿命。
图3所示的jablonski图说明了荧光共振能量转移中供体发射与受体吸收之间的耦合跃迁。吸收和发射跃迁由直的垂直箭头(分别为绿色和红色)表示，而振动松弛由波浪形的黄色箭头表示。耦合的跃迁用虚线绘制，表明如果它们是由光子介导的电子跃迁引起的，则表明它们在jablonski图中的正确位置。在合适的受体存在下，供体荧光团可以将激发态能量直接转移到受体上，而不会发射光子(如图3中的蓝色箭头所示)。所得的敏化的荧光发射具有类似于受体的发射光谱的特性。
为了使共振能量转移发生，必须满足几个标准。除了供体和受体分子的发射和吸收光谱重叠之外，两个涉及的荧光团必须位于彼此1到10纳米的范围内。如由förster推导的方程式所述(并在下文讨论)，供体分子和受体分子之间的能量转移效率随着两者之间距离的六次幂而降低。因此，供体荧光团通过非辐射相互作用将其激发能转移至受体的能力随着分子之间距离的增加而急剧下降，从而将fret现象限制在大约10纳米的大供体-受体分离半径处。在小于1纳米的距离处 能量和/或电子转移的其他几种模式也是可能的。共振能量转移过程的距离依赖性是其在研究分子相互作用中的主要基础。在涉及用供体和受体荧光团标记的分子的活细胞研究中，共振能量转移只会发生在足够接近以彼此发生生物学相互作用的分子之间。
共振能量转移的另一要求是供体分子的荧光寿命必须具有足够的持续时间以允许事件发生。在存在和不存在受体的情况下，能量转移的速率(k(t))和效率(e(t))都直接与供体荧光团的寿命相关。根据福斯特(förster)的理论并经过实验验证，能量传递的速率由以下公式给出：
kt = (1/τd) • [r0/r]6
其中r(0)是förster临界距离，τ(d)是在没有受体的情况下的供体寿命，而r是将供体和受体生色团分开的距离。förster临界距离(r(0))定义为受体与受体的分离半径，对于该半径，传输速率等于不存在受体时施主衰变(去激发)的速率。换句话说，当供体和受体半径(ř)等于förster距离，则传输效率为50%。在此分离半径下，一半的供体激发能通过共振能转移到受体，而另一半则通过所有其他可用过程的结合而耗散，包括荧光发射。
从概念上讲，förster临界距离是供体和受体分子之间的大分离长度，在该距离下仍将发生共振能量转移。临界距离值通常落在2至6纳米的范围内，这很幸运，约为许多蛋白质分子尺寸。另外，临界距离范围还对应于其他几个生物学上重要的尺寸，例如细胞膜厚度和具有多个亚基的蛋白质上的距离分离位点。r(0)的值(以纳米为单位)可以根据以下表达式计算：
r0 = 2.11 × 10-2 • [κ2 • j(λ) • η-4 • qd]1/6
其中κ平方是描述供体和受体跃迁偶极之间空间相对取向的因素，j(λ)是供体发射光谱和受体吸收光谱区域中的重叠积分(波长以纳米表示) )，η代表介质的折射率，而q(d)是施主的量子产率。
能量转移的效率e(t)是供体吸收的光子转移到受体的比例的度量，并且与供体-受体的分离距离r有关，公式如下：
r = r0 • [(1/et) - 1]1/6
和e(t)被评估为：
et = 1 - (τda/τd)
其中τ(da)是存在受体时的供体寿命，而τ(d)是存在受体时的供体寿命。因此，通过在存在和不存在受体的情况下测量供体荧光寿命(这表明由于受体导致的供体猝灭程度)，可以确定分离供体和受体分子的距离。在许多常用技术中，通过在存在和不存在受体的情况下对相对平均供体荧光强度进行稳态测量来确定能量转移效率(而不是通过测量寿命)。
总之，能量转移的速率取决于施主发射光谱和受主吸收光谱之间的光谱重叠程度(见图4)，施主的量子产率，施主和受主跃迁偶极矩的相对取向以及供体和受体分子之间的距离。影响施主与受主之间距离的事件或过程都将影响共振能量转移速率，因此，只要可以控制或消除伪影，就可以对现象进行量化。
比较它们作为荧光共振能量转移对的潜在应用时，图4给出了青色荧光蛋白(cfp，供体)和红色荧光蛋白(rfp或dsred，受体)的吸收和发射光谱。两种生物肽的吸收光谱显示为红色曲线，而发射光谱显示为蓝色曲线。供体发射光谱和受体吸收光谱之间的重叠区域由曲线底部附近的灰色区域表示。每当分子的光谱重叠增加得太远时，这种现象称为光谱渗出或交叉发生这样的情况：在受体发射通道中检测到来自受激受体的信号(来自施主的激发照明)和施主发射。结果是必须从弱受体荧光发射中提取高背景信号。
非辐射能量转移的基本理论直接适用于相隔固定距离的供体-受体对，在这种情况下，能量转移的速率是förster距离r(0)的函数，后者又取决于κ平方，j(λ)，η和q(d)。如果已知这些因素，则可以计算供体和受体之间的距离。需要使用更复杂的公式来描述多种受体生色团和距离分布等情况。表1列出了一系列实验测量的förster临界距离，这些距离是根据几种流行的供体-受体荧光团对的光谱重叠确定的。由于该变量包括供体量子产率和光谱重叠程度，这两者均取决于局部环境条件，因此应在与用于研究共振能量转移的实验条件相同的实验条件下确定福斯特距离值。
能量传递介质的折射率通常从溶剂组成中已知，或者可以针对特定的大分子进行估算，通常在水溶液中为1.4。通过与具有已知量子产率的标准荧光团比较来确定供体的量子产率。由于q(d)在r(0)的计算中显示为第六根，因此q(d)值的微小误差或不确定性不会对förster距离计算产生较大影响。同样由于第六根依赖，r(0)不受j(λ)变化的很大影响，但仍必须对每个供体-受体对评估重叠积分。通常，供体发射光谱和受体吸收光谱之间较高的重叠度会产生较大的förster临界距离值。
常见ret供体-受体对的förster临界距离
供体
受体
福斯特距离（nm）
tryptophan
dansyl
2.1
iaedans (1)
ddpm (2)
2.5 - 2.9
bfp
dsrfp
3.1 - 3.3
dansyl
fitc
3.3 - 4.1
dansyl
octadecylrhodamine
4.3
cfp
gfp
4.7 - 4.9
cf (3)
texas red
5.1
fluorescein
tetramethylrhodamine
4.9 - 5.5
cy3
cy5
>5.0
gfp
yfp
5.5 - 5.7
bodipy fl (4)
bodipy fl (4)
5.7
rhodamine 6g
malachite green
6.1
fitc
eosin thiosemicarbazide
6.1 - 6.4
b-phycoerythrin
cy5
7.2
cy5
cy5.5
>8.0
（1）5-（2-乙酰氨基氨基）氨基萘-1-磺酸
（2）n-（4-二甲基氨基-3,5-二硝基苯基）马来酰亚胺（3）羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（4）4,4-二氟-4- bora-3a，4a-diaza-s-indacene
表格1
在文献中已经广泛讨论了评估取向因子（κ平方）的不确定性，尽管有实验证据表明förster理论是有效的并且适用于距离测量，但该变量仍然存在一定争议。认识到förster距离通常是针对κ的假定值，这一点很重要-平方，通常为2/3（0.67）的动态平均值。该假定值是由于能量转移之前通过旋转扩散使供体和受体取向随机化而产生的。方向因子取决于施主发射偶极和受体吸收偶极在空间中的相对方向，范围可以从零到4。值1对应于平行的过渡偶极，而值4则由两个偶极子产生平行和共线。
由于与förster距离的第六次根关系，定向因子从1到4的变化只会使计算出的距离发生26％的变化，而当通常假定值为0.67时，大误差为35％。应用。如果偶极子彼此*垂直地定向，并且相应的κ平方值等于零，则会导致严重的潜在误差。已经采用了几种用于处理不确定性的技术，包括以下假设：存在静态取向范围，并且在荧光团的激发态寿命期间不会改变。测量供体和受体的荧光各向异性可以确定κ的极限平方变化。另外，利用具有低荧光偏振的荧光团（由于来自多个重叠跃迁的发射）减少了取向因子的不确定性。以这种方式限制κ-平方的可能值可将潜在的距离计算误差降低到大约10％。
在许多情况下，即使不是不可能，也很难确定方向系数，并且变量的确切值通常被认为是无法解决的问题。但是，一些证据表明该因素在共振能量转移计算中的重要性受到限制。使用共振能量转移光谱法和x射线衍射技术比较供体和受体的距离在很大程度上支持了该因子至少为小肽和蛋白质假设为0.67（由förster理论提出）的有效性。较大的蛋白质存在更多的不确定性。在供体和受体探针都可以自由地不受限制的各向同性运动的前提下，使用该值作为定向因子是有效的。
对于松散结合的荧光染料，单键周围的自由旋转运动应能够使用平均取向值，但通过多个连接位点结合的分子的不受限制的运动可能不会发生。另一方面，κ平方的零和4的极值要求供体和受体的荧光偏振*，这是不可能实现的条件。一些研究人员已经进行了统计计算，他们认为供体-受体分布距离及其方向决定了观察到的平均距离。只要观察到的距离存在一定的分布（并且不受施主和受主相对于r（0）太近的限制）），可以可靠地获得荧光团之间的平均距离，并评估由于取向因子而引起的不确定性。
定向因子（κ平方）对供体发射偶极子和受体吸收偶极子（图5中所示）的相对方向的依赖性由下式给出：
κ2 = (cos θt - 3cos θdcos θa)2
= (sin θd sin θacos φ - 2cos θdcos θa)2
其中θ（t）是施主的发射跃迁偶极与受体的吸收跃迁偶极之间的夹角，θ（d）和θ（a）是这些偶极与连接施主和受体的矢量之间的夹角，以及φ是包含两个过渡偶极子的平面之间的角度。
当供体与受体的间隔长度接近两个分子的förster距离（r（0））时，能量转移效率对距离变化敏感。图6示出了转移效率与分离供体和受体的距离之间的指数关系。当分离距离减小到r（0）以下时，效率迅速提高到100％，反之，当r大于r（0）时效率下降到零。由于传输效率对距离有很强的依赖性（六次方），因此仅当施主和受主半径位于förster距离内两倍时，才能可靠地测量施主与受主的分离距离。当r大约为r（0）的 50％时，共振能量转移效率接近大值，因此无法可靠地确定较短的距离。当施主-受主距离超过r（0）值50％时，曲线的斜率非常浅，无法解决更长的分离距离。
知道临界förster距离的实际意义在于，该值可为分离距离范围提供指南，该距离可由fret确定，用于给定的一对探针（请参见表1）。因为当供体-受体距离接近förster距离时，能量转移测量对距离变化非常敏感，因此目标分子相互作用的近似尺寸是选择荧光染料对时重要的因素。根据是否要进行稳态或时间分辨测量，应考虑的其他因素包括化学稳定性，量子产率和荧光团衰变寿命。由于不存在用于普通荧光共振能量转移技术的内部距离参考，
通过福斯特机理进行的共振能量转移现象在某些方面是复杂的，但在其产生的效果上却是简单且可靠的。从供体和受体的光谱性质可以准确地预测福斯特距离，并且由于尚未发现该理论的例外情况，因此可以假设在任何将供体-受体分子对紧密靠近的条件下发生共振能量转移。描述偶极转移的理论之所以复杂，不是因为转移机制本身，而是因为距离分布（包括非随机分布）的出现以及供体和受体分子的扩散。当采取步骤对一系列几何形状和时间范围内能量转移的距离依赖性求平均时
fret技术在光学显微镜中的应用
用于荧光共振能量转移研究的显微镜配置参数随荧光团，标本和成像模式的要求而变化，但是实际上任何立式或倒置显微镜都可以改装为fret显微镜（参见图7）。通常，显微镜应配备高分辨率（12位）冷却和增强型ccd摄像头系统，该系统应与高质量的干涉滤光片相连，该滤光片具有较低的串扰水平（小阻断水平）和与荧光光谱非常接近的带通区域。检测器的灵敏度决定了滤波器的通带宽度有多窄，并且仍使数据采集能够以可接受的速度进行，同时光谱泄漏噪声小。在多数情况下，
宽视场荧光显微镜的荧光团发射源于焦平面的上方和下方，从而产生具有明显失焦信号的图像，从而降低对比度并导致图像质量下降。由于共振能量转移会产生固有的低信号水平，因此在fret显微镜中使这个问题更加复杂。为了减少或消除远离焦平面的信号，可以将数字解卷积技术耦合到光学切片中，但是该过程的计算量很大，并且对于许多动态fret成像实验而言可能不够快。激光扫描共聚焦技术可应用于fret显微镜，以显着提高横向分辨率，同时能够以接近实时的间隔收集串行光学切片。共聚焦显微镜的主要缺点是激发波长仅限于可用于特定系统的标准激光线，这限制了共振能量转移实验中荧光团供体和受体对的选择。多光子激发也可以与fret技术结合使用，并且由于涉及更长的激发波长，因此对细胞的损害较小。另外，在多光子激发的受限激发体积特征内，自发荧光伪影和样品的光漂白不太可能发生。多光子激发也可以与fret技术结合使用，并且由于涉及更长的激发波长，因此对细胞的损害较小。另外，在多光子激发的受限激发体积特征内，自发荧光伪影和样品的光漂白不太可能发生。多光子激发也可以与fret技术结合使用，并且由于涉及更长的激发波长，因此对细胞的损害较小。另外，在多光子激发的受限激发体积特征内，自发荧光伪影和样品的光漂白不太可能发生。
图7显示了一种典型的显微镜结构，该结构能够观察带有几个荧光共振能量转移成像图案的培养物中的活细胞。倒置组织培养显微镜的柱子上装有标准的钨卤素灯箱，以便检查和记录细胞使用标准明场，相位对比或微分干涉对比（dic）照明。注意，后两种对比度增强技术可以与荧光结合使用，以揭示荧光团在细胞结构内的空间位置。标准的珀耳帖冷却的ccd相机系统连接到显微镜三目镜头，用于广域荧光和明场图像捕获。
使用宽场照明（汞灯）或配备有高速nipkow磁盘系统的实时扫描共聚焦附件，使用图7中所示的多光谱显微镜进行共振能量转移实验。氩-激光束首先通过声光可调波长设备进行过滤，以选择特定的激发波长，然后再进入共聚焦扫描头。使用两台高分辨率的第三代增强型冷却ccd相机（分别读取单独的通道）将图像收集起来，然后将其后台打印到主机上。沿横向（x和y）和轴向（z）平面可收集光学部分以进行三维图像重建。多种图像处理软件程序与所示的显微镜配置兼容。
根据现象的基本原理，在使用光学显微镜进行荧光共振能量转移测量时，应考虑许多重要的实践要点：
供体和受体荧光团的浓度必须严格控制。当许多受体分子围绕单个供体分子时，发生达到荧光共振能量转移的统计学概率。
必须消除光漂白，因为伪影会改变施主与受主的分子比率，从而改变共振能量转移过程的测量值。
供体荧光发射光谱和受体吸收光谱应具有基本重叠的区域。
在用于激发供体的波长范围内，受体的直接激发应小。稳态fret显微镜测量中常见的误差来源是使用受体滤光片组检测供体发射。
供体和受体的发射波长必须与检测器的大灵敏度范围一致。
供体的吸收和发射光谱应具有小的重叠，以减少供体之间的自转移的可能性。
供体分子必须是荧光的并且具有足够长的寿命，以便发生共振能量转移。
供体应表现出低极化各向异性，以减少取向（κ平方）因子值的不确定性。捐助者满足了这一要求，这些捐助者的发射是由几个重叠的激发跃迁引起的。
使用抗体标记技术时，与供体和受体荧光染料偶联的试剂的生物学活性不应改变。活性的任何降低都会严重影响所得共振能量转移测量的有效性。
因为荧光共振能量转移要求供体和受体分子具有适当的偶极排列，并且彼此之间位于10纳米之内，所以必须考虑与分子连接的试剂的三级结构。例如，当供体-受体分子可以连接到蛋白质上的不同结构位置（例如羧基或氨基末端）时，即使蛋白质相互作用，也可能不会观察到fret，因为供体和受体分子位于相互作用分子的相对端。
应当使用传统的免疫组织化学技术对标记有绿色荧光蛋白突变体以进行fret研究的活细胞进行分析，以验证标记的蛋白具有与天然蛋白相同的细胞内生境和特性。
为了使荧光共振能量转移现象提供有意义的数据作为光学显微镜中的工具，必须同时优化样品制备和成像参数。合适的供体和受体探针的选择以及它们用作分子标记的方式是一个重大挑战。另外，一旦阐明了允许能量转移的标记策略，便可以使用各种各样的技术本身来进行测量。大多数定量荧光显微镜检查是通过测量荧光发射强度进行的。基于荧光强度的fret检测通常是通过监测与供体和受体生色团相对应的两个波长处发射强度的相对量的变化来实现的。i（a））伴随着供体发射强度（i（d））的降低。
尽管可以将供体或受体相对发射强度的变化视为共振能量转移的指示，但通常的方法是利用两个值的比率i（a）/ i（d），以衡量fret。该比率的值取决于施主-受主对之间的平均距离，并且对激发光束进入的路径长度和体积的差异不敏感。任何引起分子对之间相对距离变化的样品条件都会改变供体和受体发射比。因此，可以通过优先激发供体荧光团并检测相互作用的受体荧光团的发射增加来检测显微镜下的fret，伴随着由于能量转移而猝灭产生的供体荧光减少。使用强度监测方法测量fret被称为稳态荧光共振能量转移成像。
根据它们的吸收和发射光谱特征选择合适的供体和受体探针。为了获得大的共振能量转移，供体的发射光谱应与受体的吸收光谱基本重叠。另外，在给体的激发大值处，受体荧光团的直接激发应该小，并且在发生受体发射的波长区域中，在给体和受体之间不应有明显的发射重叠。在实践中，可能难以确定满足这些要求的供体-受体对。市售的荧光滤光片套件无法*有效地仅通过所需的波长，因此情况通常会变得复杂。设计通带之外的一小部分光可能会被传输。除非使用非常好的表征和受控的表达系统，否则可能难以确定供体和受体荧光团的精确浓度。自发荧光，光致漂白和背景荧光也可能需要进行其他校正。
图8展示了活细胞培养物中细胞内蛋白质-蛋白质结合的典型研究，研究了与细胞凋亡相关的事件，细胞凋亡是由一系列复杂的顺序相互作用导致的细胞死亡的生理过程。可以通过与荧光蛋白家族的适当成员（在这种情况下，bfp和gfp）融合来标记直接参与事件链的基因产物，以便在同一细胞中共表达，从而通过fret探测特异性结合。随着程序性细胞死亡的进行，参与凋亡的蛋白质在线粒体内相互作用并显示出结合的逐渐减少。因此，供体发射的图像（图8（a））仅包含bfp标记的蛋白质的荧光，而相应的受体发射曲线（图9（b））则说明了被gfp标记的蛋白质（以及供体发射的某些贡献）引起的信号。如下所述，fret滤光片（图8（c））揭示了源自两种蛋白质之间共振能量转移的荧光
通常，可能会影响荧光共振能量转移测量准确性的因素中，有几个对光学显微镜具有高度特异性。显微镜研究的主要目标是获得高分辨率图像，这需要特别注意用于光谱区分供体和受体的吸收和发射波长的光学滤光片的质量和性能。为了地提高信噪比（不对样品或所研究的过程造成不利影响），有必要在激发光照射的强度和时间与供体和受体荧光团以及检测器的浓度之间取得平衡。效率。如果供体-受体荧光团的浓度过高，可能会发生自我猝灭，从而影响fret测量的准确性。光漂白是所有荧光团的问题，会影响供体与受体的比例，从而改变荧光测量结果。过度的照明强度也会损坏标本，尤其是那些含有活细胞或组织的标本。
一种称为供体光漂白荧光共振能量转移（pbfret）的技术，它利用光漂白过程来测量fret，通常用于固定标本的研究中。基于逐个像素的分析，该方法已应用于测量荧光团偶联的单克隆抗体标记的细胞表面蛋白之间的邻近关系。光漂白fret基于以下理论：荧光团仅在升高到激发态时才对光损伤敏感。从统计上讲，任何时候只有一小部分分子处于激发态，因此，具有更长荧光寿命的荧光团遭受光损伤的可能性更高，并且呈现出更高的光漂白率。
支持该概念的实验证据表明，荧光团的光漂白时间与其激发态寿命成反比。共振能量转移的发生降低了供体分子的荧光寿命，有效地保护了其免于光致漂白。pbfret的计算基于相对于在没有共振能量转移的情况下测得的供体光漂白率的降低。fret研究中光漂白的测量需要相对较长的时间，因此于时间数据不重要且光漂白对细胞功能的影响不是问题的固定细胞标本。在某些方面，施主光漂白技术不如敏化发射测量复杂，
能量转移效率也可以通过受体光漂白技术来确定，其中通过比较选择性光漂白受体分子之前和之后的值来测量供体发射猝灭的变化。在去除受体之前和之后，分析相同样品区域中供体荧光强度的变化，具有仅需准备单个样品的优点，并将能量转移效率直接与供体和受体荧光相关。
在显微镜中准确测量荧光共振能量转移需要补偿所有潜在的误差源。已经开发出一种简单的技术来校正利用受体发射滤光片检测供体荧光和利用施主发射滤光片检测受体荧光（由于交叉或光谱渗漏）。该方法还校正了fret对供体和受体荧光团浓度的依赖性。需要少光谱信息的测量策略利用了三个滤波器组的组合，可以很容易地实现。供体，fret和受体滤光片组设计用于隔离和大化三个特定信号：供体荧光，归因于fret的受体荧光和直接激发的受体荧光，分别。在实践中，分别使用三个过滤器组检查了三个仅包含供体，正受体以及供体和受体的不同样品，并对所得数据进行了算术运算以校正交叉和供体-受体浓度的不受控制的变化。
图9所示为交叉（频谱渗漏）和滤波器串扰的示意图，这是要在荧光共振能量转移实验中获得定量结果必须克服的两个重要问题。交叉或渗漏通过供体荧光发射光谱与图9中受体发射干扰滤光片的带通区域的重叠来体现，导致供体发射信号（不需要的波长）通过发射滤光片传输。相比之下，滤波器串扰描述了串联在一起放置的两个滤波器在特定范围内的小衰减（阻塞）水平，并且在为荧光组匹配激发和发射滤波器时要引起关注。双色镜通常包含在荧光滤光片组合的串扰评估中。尽管很少将两个发射滤光片同时放置在光路中，但在图9中将光谱绘制在一起以同时说明两个概念。请注意，两个滤光片光谱（蓝色和红色曲线）代表干涉滤光片的透光率，而施主发射曲线（绿色）是强度与波长的关系图。
当采用稳态fret测量技术时，可能会引入重大错误的其他因素也需要进行校正。此外，需要仔细控制供体和受体荧光团的浓度。通过时间分辨，可以部分避免荧光团浓度的测定荧光测量，可提供一种无需精确了解供体浓度即可获得平均寿命的方法。该技术能够定量确定供体-受体间隔距离，并且基于在存在和不存在受体的情况下对供体寿命的测量。通过测量荧光强度随时间的变化，可以阐明激发态分子的发射动态，因此，可以获得有关供体-受体相互作用性质的更详细的信息。强度衰减的图形表示了荧光衰减过程的时间平均细节（请参见图10（a）），在采用稳态技术时无法解决。表示平均寿命相同值的测量值，
荧光团的荧光寿命（τ）是分子返回基态之前处于激发态的特征时间。代表在短暂激发光脉冲之后简化的单指数形式的荧光衰减，荧光强度随时间（t）的变化由以下公式给出：
i(t) = i0 exp (-t/τ)
其中i（0）是紧接激发光脉冲之后的初始荧光发射强度，i（t）是在时间t测量的荧光强度。荧光寿命（τ）定义为强度衰减到其初始值的1 / e（大约是i（0）的 37％；图10（a））所需的时间，并且是速率常数的倒数从激发态到基态的荧光衰减。
时间分辨与稳态fret测量的主要整体优势在于，可以以更高的定量精度绘制供体-受体间隔距离。这部分地是因为荧光寿命不取决于局部强度或浓度，并且很大程度上不受荧光团的光漂白的影响。然而，荧光寿命对荧光团环境高度敏感，即使具有相似光谱的分子在不同环境条件下也可能显示出不同的寿命。因为散射不会影响荧光团的寿命，所以寿命变化的测量可以提供与局部分子过程特别相关的信息。
荧光团的寿命会受到局部微环境中众多变量的影响，包括诸如疏水性，氧浓度，其他介质成分的离子强度，与大分子的结合以及与受体分子的接近度等因素，这些因素会耗尽激发态。共振能量转移。寿命测量可以作为分子相互作用的指标，并且与荧光团浓度无关，这是一个重要的实践优势。
通常用于测量荧光寿命的两种通用技术分为时域（脉冲的，见图10（a））和频域（也称为相位分辨的）。; 图10（b））方法。时域寿命测量使用脉冲激发光源，并且荧光寿命是通过直接测量发射信号或通过光子计数检测获得的。频域方法利用激发光源的正弦调制（从脉冲或调制激光系统获得），并根据荧光发射信号的相移和解调深度确定寿命。这些荧光寿命成像方法中的每一种都有特定的优点和缺点，并且都已广泛应用于常规的宽视野，共聚焦和多光子显微镜。
图10中示出了表示用于确定荧光寿命的时域和频域技术的示意图。在时域方法中（图10（a）），样品被短暂的激光脉冲激发，该脉冲的持续时间比被激发物质的寿命短得多，并且指数衰减曲线是随时间变化的。荧光衰减通常是单个荧光团的单指数函数，但是如果激发态在环境中具有许多可用的弛豫途径，则荧光衰减可以显示出更为复杂的特性。在频域实验中，来自与声光调制器耦合的连续波激光器的正弦调制光用于激发荧光团（图10（b））。产生的荧光发射以与激发相同的频率进行正弦调制，但伴随有相移和调制深度的减小。在单指数衰减的情况下，可以通过确定相移程度（φ或调制比（m），使用图10（b）中所示的公式。如果两个值相同，则荧光衰减实际上由单个指数函数组成。如果存在多个荧光物质（或单个荧光团遇到复杂的环境），则应在很宽的频率范围内评估相移和调制寿命。
测量荧光寿命的时域技术基本上依赖于单光子计数，并且需要具有足够时间分辨率的检测系统来收集每个激发脉冲产生的近100％的光子。尽管相位分辨技术对执行的要求相对较低，但它们通常不如光子计数方法那么灵敏。当采用相位调制来解决复杂的多荧光团寿命时，对于某些标本来说，长时间暴露于破坏性激发照明下可能证明是多余的，并且可能无法为活细胞过程提供足够的时间分辨率。技术取决于调查所需的信息和所研究样本的类型。
荧光寿命测量已被证明是fret的敏感指标，并且由于其寿命测量不受浓度（例如浓度和光程长度）等因素的影响，因而在活细胞研究中具有特殊优势，而这些因素在活体样本中难以控制。通过荧光寿命测量进行fret研究的主要优势在于，即使在具有相似发射光谱的供体-受体对之间也可以区分能量转移。当直接测量荧光寿命（与使用稳态值相反）时，无需对施主或受主荧光团进行光致破坏即可测定fret。由于fret通过能量转移到受体而缩短了供体分子的荧光寿命，τ（da））到不存在受体（τ（d））的情况下，就可以为每个图像像素计算fret效率值（e（t））。
根据技术的不同，荧光寿命的测量需要将样品暴露于激发光的高频重复脉冲或连续正弦调制光下。在活细胞研究中，必须始终评估高强度照明的效果。无论采用哪种方法，必须在与供体-受体测量相同的实验条件下确定不具有供体的供体的参考寿命。用单个样品完成此操作的一种方法是，在能量转移实验之后，测量光漂白破坏受体后的仅供体寿命。
结论
在生物学研究中，荧光共振能量转移的见应用是测量大分子（通常是蛋白质或核酸）上两个位点之间的距离或检查生物分子实体之间的体内相互作用。蛋白质可以用合成荧光染料或免疫荧光团标记，以充当供体和受体，但是荧光蛋白遗传学的进展现在使研究人员能够使用具有不同光谱特征的多种生物荧光团来标记特定的靶蛋白。在许多情况下，氨基酸*被用作内在的供体荧光团，其可以与用作受体的任意数量的外在探针偶联。
如果大分子用单个供体和受体标记，并且在供体激发态寿命期间两个荧光染料之间的距离没有改变，那么可以通过稳态测量从能量转移的效率来确定探针之间的距离，以上。在供体和受体之间的距离围绕分布曲线波动的情况下，例如蛋白质装配体，膜，单链核酸或未折叠的蛋白质（请参见图11中所示的场景），仍然可以使用fret来研究现象，但时间分辨寿命测量是。图11说明了两种情况下的几种生物学应用，包括构象变化，解离或水解，膜状脂质囊泡融合，
尽管有各种方法可用于测量光学显微镜中的荧光共振能量转移，但没有一种方法**。有些技术需要更复杂和昂贵的仪器，而另一些则基于必须仔细验证的假设。某些方法适用于固定样本，但不能应用于活细胞系统，而其他方法则必须包含大量的校正计算或数据分析算法。但是，可以肯定的是，fret分析显示了在生物学应用的实用性和范围上进一步发展的巨大希望。近年来，仪器仪表已取得了巨大的进步，特别是在时间分辨技术方面。
成熟的皮秒和纳秒技术现在可以帮助完成过去仅很难完成的荧光寿命测量。荧光探针开发的进步产生了更小，更稳定的分子，并具有与生物靶标结合的新机制。也已经开发出具有广泛的固有激发态寿命的荧光团，并且正致力于开发荧光蛋白的遗传变异中更大的多样性。全新的荧光材料类别，其中许多比以前的荧光团小，并且可以在较低的分离距离下评估分子相互作用，有望提高标记的多功能性，并导致fret技术的新应用。
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