影响免疫组化（IHC）实验结果的因素有哪些？
免疫组化技术是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂通过借助显微镜的观察，从而在抗原抗体结合部位确定组织细胞结构的一门组化技术。那么影响免疫组化实验结果的因素有哪些呢？让我们一起来看看吧！
一、组织的固定
组织固定的好坏直接影响免疫组化的结果，选择良好的固定液并及时充分的固定可以防止组织自溶，最大限度保留组织的抗原性，保证免疫组化结果的准确性。
常用固定液：
10%的中性缓冲福尔马林（40%甲醛10ml+0.01mol/lpbs90ml(ph7.4)），一般固定液的量为组织块体积的4~10倍，固定时间（常温条件下固定8~24h）。
二、组织的脱水
组织脱水不che底，会出现组织掉片的现象，而且显色效果差，容易混淆诊断。
为保证组织脱水che底，应制定相应的更换试剂的制度，及时更换并有专人负责，做好相应的记录。
三、切片
玻片选择粘附载玻片，切片不宜厚，推荐厚度3~5μm，可以保证后续修复时最大限度暴露抗原。切片无皱褶、无气泡，烤片温度设置65~68℃，时间为3小时。烤片不充分会导致组织脱片影响后续的检测，但烤片也不宜过度，温度过高会加速抗原氧化，导致抗原丢失。
四、阻断内源酶
进行免疫组化标记的组织，通常含有一定量的内源性酶，由于在免疫组化染色过程中，大部分抗体是用过氧化物酶来标记的。
比如我们通常使用hrp即辣根过氧化物酶标记的二抗，酶起催化作用，促进底物的结合，而组织中的内源性酶同样也能催化底物，这就影响了免疫组化的特异性。所以在加酶标二抗之前，应先用过氧化氢阻断内源酶，将对后续检测结果的影响降到zui低。
五、抗体的选择和使用
选用与使用的一抗同源性的二抗。要选择适宜的一抗，不同的二抗与一抗浓度不匹配，都不能得到满意的结果。
在滴加一抗、二抗时要先轻轻倾去pbs液，选用韧性好、吸水性强的纸巾吸干组织周围液体，轻压组织面吸干组织表面水分(不能滑动)，防止试剂被稀释或致浓度不均，立即滴加适量试剂，用细玻棒将试剂扩展至组织外1～2mm，防止出现边缘效应，不能触碰组织，液面厚约1mm为宜。
一抗孵育温度一般设置37℃1小时或者4℃冰箱孵育过夜，二抗室温孵育30-60min。为保证实验结果的可靠性，推荐在实验中设置同片的阳性对照和阴性对照。
试剂表面的气泡用玻棒点破，否则气泡张力作用会导致局部无试剂，出现气泡下假阴性反应。
六、显色反应
dab显色剂须现配现用，切片多时应分次配制，分批显色。根据温度和整体显色情况决定终止反应，一般显色时间3～5min，时间过长致显色过深和背景着色，过短致反应不足或出现假阴性。
由于dab有一定的毒性，在操作时要特别注意自身的防护，实验器材专用，以防污染。
七、试剂的保存
因为抗体是蛋白质，保存或使用不当不但会造成浪费，而且变质会出现假阴性结果。
要注意抗体的有效期，对于一次用不完的抗体可保存在冰箱内，而不要放在冷冻室，反复冻融，抗体效价会急剧下降而失效。
同时防止抗体的相互交叉污染和细菌污染。
更多有关免疫组化实验的影响因素，请联系天津益元利康生物科技有限公司：
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常用固定液：
10%的中性缓冲福尔马林（40%甲醛10ml+0.01mol/lpbs90ml(ph7.4)），一般固定液的量为组织块体积的4~10倍，固定时间（常温条件下固定8~24h）。
二、组织的脱水
组织脱水不che底，会出现组织掉片的现象，而且显色效果差，容易混淆诊断。
为保证组织脱水che底，应制定相应的更换试剂的制度，及时更换并有专人负责，做好相应的记录。
三、切片
玻片选择粘附载玻片，切片不宜厚，推荐厚度3~5μm，可以保证后续修复时最大限度暴露抗原。切片无皱褶、无气泡，烤片温度设置65~68℃，时间为3小时。烤片不充分会导致组织脱片影响后续的检测，但烤片也不宜过度，温度过高会加速抗原氧化，导致抗原丢失。
四、阻断内源酶
进行免疫组化标记的组织，通常含有一定量的内源性酶，由于在免疫组化染色过程中，大部分抗体是用过氧化物酶来标记的。
比如我们通常使用hrp即辣根过氧化物酶标记的二抗，酶起催化作用，促进底物的结合，而组织中的内源性酶同样也能催化底物，这就影响了免疫组化的特异性。所以在加酶标二抗之前，应先用过氧化氢阻断内源酶，将对后续检测结果的影响降到zui低。
五、抗体的选择和使用
选用与使用的一抗同源性的二抗。要选择适宜的一抗，不同的二抗与一抗浓度不匹配，都不能得到满意的结果。
在滴加一抗、二抗时要先轻轻倾去pbs液，选用韧性好、吸水性强的纸巾吸干组织周围液体，轻压组织面吸干组织表面水分(不能滑动)，防止试剂被稀释或致浓度不均，立即滴加适量试剂，用细玻棒将试剂扩展至组织外1～2mm，防止出现边缘效应，不能触碰组织，液面厚约1mm为宜。
一抗孵育温度一般设置37℃1小时或者4℃冰箱孵育过夜，二抗室温孵育30-60min。为保证实验结果的可靠性，推荐在实验中设置同片的阳性对照和阴性对照。
试剂表面的气泡用玻棒点破，否则气泡张力作用会导致局部无试剂，出现气泡下假阴性反应。
六、显色反应
dab显色剂须现配现用，切片多时应分次配制，分批显色。根据温度和整体显色情况决定终止反应，一般显色时间3～5min，时间过长致显色过深和背景着色，过短致反应不足或出现假阴性。
由于dab有一定的毒性，在操作时要特别注意自身的防护，实验器材专用，以防污染。
七、试剂的保存
因为抗体是蛋白质，保存或使用不当不但会造成浪费，而且变质会出现假阴性结果。
要注意抗体的有效期，对于一次用不完的抗体可保存在冰箱内，而不要放在冷冻室，反复冻融，抗体效价会急剧下降而失效。
同时防止抗体的相互交叉污染和细菌污染。
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