涨知识|qPCR专场八：细节-认真的态度和科学的精神
涨知识|qpcr专场八：细节-认真的态度和科学的精神
荧光定量pcr是实验室中出镜率非常高的一种检测方法。该方法通过在pcr体系中添加荧光基团来记录dna产物的累积情况，从而达到对pcr过程进行实时监控的目的，并且可以通过数据分析计算出起始模板量，这就是“荧光定量”中“定量”一词的来源。
荧光定量pcr实验需要用心对待，各种细小的偏差都会导致实验出现结果不准确或难以理解的现象。小事成就大事，细节成就。接下来小翌给大家来介绍一下荧光定量pcr中需要注意的小细节。
rna保证可用rna的完整度在很大程度上影响着cdna合成的长度与质量。在进行rna提取、处理、储存等实验过程中需要采取特殊的保护措施，如操作者佩戴手套和口罩，全程使用无rna酶污染的实验耗材等；rna存储尽可能采用-80℃保存，且减少反复冻融。rna的完整性可通过agilent 2100生物分析仪进行分析，其在分析rna完整性之后能够给出准确的数值（rin值，全称 rna intesity number），该值在8-10之间表示rna质量非常好，小于7时表示rna完整度较差。
但是在多数实验室中，一般不会有agilent 2100生物分析仪。在这种情况下，我们可以采用一种最快速的方式检测rna完整性---凝胶电泳。进行rna凝胶电泳时，需要保证全程无核酸酶干扰的风险。电泳槽、配制瓶、制胶套件、电泳槽用depc水冲洗干净，琼脂糖和电泳液需要是新开封的，从而保证rna在上样及电泳过程中不会被核酸酶降解。电泳时需要合理选择电压和电泳时间，电压过高或长时间电泳会产生大量热量，从而导致rna降解。
▲高质量的rna电泳会有三条比较明显的条带，分别是28s，18s与5s核糖体rna条带，并且28s与18s的条带亮度之比大体为2：1。当rna出现降解时，条带会呈现弥散状。
前期准备稳妥01实验仪器的准备
常用的移液枪和进行荧光定量pcr的qpcr仪器需要确认定期有做过校正，通常校准周期是一年，从而保证加样的准确性和检测的准确性。移液枪在使用之前用酒精擦拭枪杆并擦干放置一会儿，以减少污染的风险。
02
内参基因的准备
为了使用实时荧光定量pcr对所选基因进行准确且可重现的表达分析，使用可靠的内参基因在实验之间标准化表达水平至关重要。gapdh、β-actin和18s rrna等是最为常见的内参基因，但是无论选择哪个基因作为内源性对照，都必须对该基因进行测试，以确保在所有所需的实验条件下基因的一致表达。
gapdh不适合选作内参的情况
gapdh基因是糖酵解中的关键基因，在代谢过程中的表达很容易受到多种因素的影响。如在细胞的增殖过程中，细胞需要的能量atp增多，糖酵解代谢加大，gapdh基因的表达水平很有可能被上调。有报道称，该基因可作为肿瘤发生的标志物，在肿瘤组织与正常细胞及癌旁正常组织比较时，gapdh表达并不一致。故在比较肿瘤组织与正常组织或细胞的某种基因或蛋白的表达时，gapdh作为内参应慎重。
β-actin不适合选作内参的情况
对于actin蛋白由几种异构体组成，actin大致可以分为6种，不同actin之间具有较大的序列相似性(>90%)。在肌肉组织中β-actin分布很少，心肌中主要是alpha-cardiac muscle actin蛋白。故并不是所有的组织都适合选β-actin作为内参。例如当细胞向恶性转化时，β-actin mrna的表达水平增加；而假基因的存在也可干扰β-actin的检测，此时并不适合选择β-actin作为内参。
18s rrna不适合选作内参的情况
rrna的转录易受到各种生物因素和药物的影响。在有丝分裂期间，28s、18s rrna明显减少或停止表达。此外存在很大争议的是rrna不包括poly(a)尾，在以oligo(dt)为引物的cdna合成中不能被逆转录，建议在反转录的过程中除用oligo(dt)引物外，还要用18s作为反向引物，反转录后的cdna最好用rna酶处理一下，再高温灭活。
▲确定用于人胰腺器官组织 rt-qpcr 分析的最佳内参基因(cherubini, alessandro et al. plos one. 2021)如何选用合适的内参？通过查询研究相同或类似对象的文献，获取相关的内参信息并测试；查询实时定量pcr内参基因知识库—icg,获取相关的内参信息并测试；选择实验室已经常用的内参，进行预实验测试。
03靶标基因引物的准备进行引物设计后，进行预实验验证，选取扩增效率在90%-110%(最佳95%-105%)之间，且熔解曲线为单峰的引物。
注重加样细节01加样环境需保证
荧光定量pcr实验的灵敏度很高，在配制预混液的时候需在超洁净平台中进行，以防止外源的污染。一些预混液在室温下是稳定的，但最佳做法是将试剂成分、酶和样品保存在冰上。另外在进行染料法(sybr)荧光定量实验时, 需要避免强光照射，强光照设会导致sybr淬灭。
02试剂准备需注意
不要涡旋震荡含酶的混合物，因为其对干扰高度敏感。仅轻轻旋转或颠倒含酶的预混液即可。pcr引物和解冻的核酸可以通过轻轻且短暂的涡旋混合一到两秒钟。
03加样过程需谨慎
加样顺序尽量选用先加大体积，后加小体积的方式；先加ntc，后加模板。加样顺序的把控可尽可能减少操作误差和污染风险。枪头勤更换，以减少交叉污染的风险。在重复组和样品类型之间需在每次吸取后更换枪头。在加样过程中，不要让枪头穿过其他孔或不同的样品/检测类型。灵活使用移液枪，尽可能提升孔间重复和加样精准。针对10μl及以下的小体积液体吸取，采用二档吸取(按到底)，一档排出(不按到底)。当孔中有液体时，小体积液体加样，需选用低吸附枪头伸入至液面以下进行排出，减少液体残留在枪头内的现象。
04密封、混合需全面
加样至96孔板前后，切勿使用记号笔等在板的表面或者板底部写字，这会干扰荧光激发和信号检测。另外类似墨水等物质可能会在qpcr仪器中从板上转移至仪器模块上，这类有色或荧光物质污染模块后会对当前乃至后续的荧光定量pcr数据产生不利影响。用封板膜封板后，需检查板的顶部以及验证是否与板良好接触，尤其是边缘部分。在正式上机前需对反应组分充分离心混合，若混合不均匀，精准度和效率可能会受到影响。另外需检查孔中是否存在气泡或黏附在孔壁上，若存在，需轻轻敲击管子底部后短暂离心，从而消除溶液中的气泡。
全面程序检查
除了根据说明书仔细调整设置好反应的温度、时间和循环次数外，还需要注意以下事项：反应体积是否填写正确---需按照实际反应体积来进行填写；延伸环节荧光采集开关是否打开---若荧光采集开关未打开，则会发生无扩增曲线的现象；熔解曲线程序不同仪器各不相同，上图中仅以abi q5为例，通常选用仪器默认的信号采集程序即可。
以上是对荧光定量pcr实验中细节注意的介绍，相信小伙伴们通过小翌的介绍，今后会针对这些细小问题已经有一定的信心啦。关于如何做好qpcr实验，小翌本次给大家展示的是最终章啦，从专场一到专场八，小翌针对荧光定量pcr实验中可能出现的问题和困惑做了针对性介绍，希望能够对小伙伴们的实验有所帮助。当然，还有很多知识，小翌还没有介绍到，小伙伴们不要忘记自主学习哦！
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货号
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同trizol提取
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qpcr染料法
高灵敏通用型定量预混液(染料法)
hieff unicon®universal blue qpcr sybr master mix
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高灵敏型qpcr预混液（染料法）
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mirna加a法高特异性定量预混液(染料法)
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细胞直扩rt-qpcr，1.5 h从细胞到基因表达分析(染料法)
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反转录试剂
5 min快速反转，最长可满足14 kb cdna合成，含gdna去除(下游应用pcr/qpcr)-示踪版new
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5 min快速反转，最长可满足14 kb cdna合成，含gdna去除(下游应用pcr/qpcr)-常规版new
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15 min一步完成gdna去除与反转录(下游应用qpcr)
hifair®v one-step rt-gdna digestion supermix for qpcr
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链cdna合成预混液，含gdna去除(下游应用qpcr)
hifair®iii 1st strand cdna synthesis supermix for qpcr (gdna digester plus)
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最长可满足19.8 kb cdna合成试剂盒，含gdna去除(下游应用pcr/qpcr)
hifair®iii 1st strand cdna synthesis kit(gdna digester plus)
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常规30 min反转预混液,含gdna去除（下游应用qpcr）
hifair®ii 1st strand cdna synthesis supermix for qpcr (gdna digester plus)
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mirna反转录试剂盒（加a法）
hifair®mirna 1st strand cdna synthesis kit （加a法）
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GIGAHERTZ PT-9610 宽带辐射计用于激光功率及其噪声成分
兔抗人免疫球蛋白M（IgM）抗体血清
列管多效蒸馏水机工作原理
调节池潜水搅拌机是水处理工艺中的重要一环
液位传感器（HYDAC）ENS 3000 德国贺德克
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日本欧姆龙OMRON接近传感器种类
高低温恒定湿热试验箱文献
包装跌落试验机需要确认哪些规格参数
防风抑尘网采用金属材料制作
KCB型齿轮泵特点性能应用及使用范围
西门子TP1900 精智 Comfort 面板19” 宽屏 TFT
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无线可燃气体探测器的适用场合—乐鸟
普通的公制、英制、美制螺纹计算公式
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直流电动机平稳运行的方法和工作原理
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荧光定量pcr实验需要用心对待，各种细小的偏差都会导致实验出现结果不准确或难以理解的现象。小事成就大事，细节成就。接下来小翌给大家来介绍一下荧光定量pcr中需要注意的小细节。
rna保证可用rna的完整度在很大程度上影响着cdna合成的长度与质量。在进行rna提取、处理、储存等实验过程中需要采取特殊的保护措施，如操作者佩戴手套和口罩，全程使用无rna酶污染的实验耗材等；rna存储尽可能采用-80℃保存，且减少反复冻融。rna的完整性可通过agilent 2100生物分析仪进行分析，其在分析rna完整性之后能够给出准确的数值（rin值，全称 rna intesity number），该值在8-10之间表示rna质量非常好，小于7时表示rna完整度较差。
但是在多数实验室中，一般不会有agilent 2100生物分析仪。在这种情况下，我们可以采用一种最快速的方式检测rna完整性---凝胶电泳。进行rna凝胶电泳时，需要保证全程无核酸酶干扰的风险。电泳槽、配制瓶、制胶套件、电泳槽用depc水冲洗干净，琼脂糖和电泳液需要是新开封的，从而保证rna在上样及电泳过程中不会被核酸酶降解。电泳时需要合理选择电压和电泳时间，电压过高或长时间电泳会产生大量热量，从而导致rna降解。
▲高质量的rna电泳会有三条比较明显的条带，分别是28s，18s与5s核糖体rna条带，并且28s与18s的条带亮度之比大体为2：1。当rna出现降解时，条带会呈现弥散状。
前期准备稳妥01实验仪器的准备
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02
内参基因的准备
为了使用实时荧光定量pcr对所选基因进行准确且可重现的表达分析，使用可靠的内参基因在实验之间标准化表达水平至关重要。gapdh、β-actin和18s rrna等是最为常见的内参基因，但是无论选择哪个基因作为内源性对照，都必须对该基因进行测试，以确保在所有所需的实验条件下基因的一致表达。
gapdh不适合选作内参的情况
gapdh基因是糖酵解中的关键基因，在代谢过程中的表达很容易受到多种因素的影响。如在细胞的增殖过程中，细胞需要的能量atp增多，糖酵解代谢加大，gapdh基因的表达水平很有可能被上调。有报道称，该基因可作为肿瘤发生的标志物，在肿瘤组织与正常细胞及癌旁正常组织比较时，gapdh表达并不一致。故在比较肿瘤组织与正常组织或细胞的某种基因或蛋白的表达时，gapdh作为内参应慎重。
β-actin不适合选作内参的情况
对于actin蛋白由几种异构体组成，actin大致可以分为6种，不同actin之间具有较大的序列相似性(>90%)。在肌肉组织中β-actin分布很少，心肌中主要是alpha-cardiac muscle actin蛋白。故并不是所有的组织都适合选β-actin作为内参。例如当细胞向恶性转化时，β-actin mrna的表达水平增加；而假基因的存在也可干扰β-actin的检测，此时并不适合选择β-actin作为内参。
18s rrna不适合选作内参的情况
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04密封、混合需全面
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