3-磷酸甘油醛脱氢酶活性终点比色法定量检测试剂盒
主要用途
3-磷酸甘油醛脱氢酶（gapdh）活性终点比色法定量检测试剂是一种旨在通过3-磷酸甘油磷酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶酶偶联反应系统中，伴随的还原腺嘌呤二核苷酸（nadh）氧化后峰值的降低，即采用比色法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞、组织、血液等裂解悬液样品3-磷酸甘油醛脱氢酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；gapdh；ec1.2.1.12）是一种四聚体的酶蛋白，参与催化糖酵解，分解葡萄糖分子，为机体提供能量和碳分子。同时具有转录激活、凋亡启动等功能。3-磷酸甘油醛脱氢酶存在于所有生物体的细胞浆中，而作为看家基因，常用于rna和蛋白表达分析的内参标准。通过3-磷酸甘油磷酸激酶（3-phosphoglyceric phosphokinase；3-pgk）和3-磷酸甘油醛脱氢酶酶偶联反应系统，首先底物3-磷酸甘油（3-phosphoglyceric acid；3-pga）受到3-磷酸甘油磷酸激酶催化磷酸化反应，产生1,3-二磷酸甘油（glycerate-1,3-diphosphate）；进而由3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用，产生3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde-3-phosphate；g-3-p），同时其辅酶因子还原型腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；β-nadh）转化为氧化型腺嘌呤二核苷酸（oxidizednicotinamide adenine dinucleotide；β-nad），通过测定吸光值的变化（340nm 波长），来定量分析3-磷酸甘油醛脱氢酶的总活性。其反应系统为：
3-pgk
3-phosphoglyceric acid+ atp→ glycerate-1,3-diphosphate+ adp
gapdh
glycerate-1,3-diphosphate+ β-nadh→ glyceraldehyde-3-phosphate+ β-nad + pi
产品内容
缓冲液（reagent a） 5毫升
反应液（reagent b） 500微升
底色液（reagent c） 500微升
阴性液（reagent d） 500微升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；反应液（reagent b）和底色液（reagent c）避免光照；有效保证6月
用户自备
96孔板：用于比色的容器
酶标仪：用于样品比色分析
实验步骤
一、测定准备
1．开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长340nm，并置零
2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底色液（reagent c）避免光照
3．缓冲液（reagent a）室温下均衡温度
二、活性测定
1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取75微升缓冲液（reagent a）到96孔板里
3．分别加入10微升反应液（reagent b）
4．分别加入10微升底色液（reagent c）
5．轻轻摇动96孔板
6．在25℃温度下孵育3分钟
7．分别加入5微升阴性液（reagent d）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
8．轻轻摇动96孔板
9．在25℃温度下孵育10分钟
10．即刻放进酶标仪检测
11．活性计算
[（样品读数－背景读数）x样品稀释倍数x 0.10（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）x 6.22（毫摩尔吸光系数）x 0.6（光径距离；厘米）x10（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔3-磷酸甘油醛/分钟
注意事项
1．本产品为50次操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．样品须澄清，至关重要
5．孵育完成后即刻比色测定
6．测定值由高到低变化；测定持续10分钟
7．样本测定10分钟读数低于0分钟读数表明具有酶活性
8．比色测定后，比色皿须清洗
9．建议待测样本蛋白浓度为20微克/5微升（本公司提供 bradford蛋白质浓度定量试剂盒－hl30030.1）
10．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
11．3-磷酸甘油醛脱氢酶单位活性定义为：在25℃，ph 7.6条件下，每分钟内能够转化1微摩尔3-磷酸甘油至3-磷酸甘油醛所需的酶量作为一个活性单位
12．本公司提供系列医学生化经典分析试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感
关键词：酶标仪
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7．分别加入5微升阴性液（reagent d）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
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