Trizol法提取RNA实验步骤
一、分离纯化的基本原理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化rna。rna质量的高低常常影响cdna库，rt-pcr和northern blot等分子生物学实验的成败。trizol是一种新型总rna抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、试剂和材料
无水乙醇、氯fang、glycogen（可能需要）、 1.5ml eppendorf管（rnase-free）、 tips（rnase-free）
三、准备工作
rnase酶非常稳定，是导致rna降解zui主要的物质。它在一些的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是rnase*失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与rna制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。 rnase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用depc配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取rnase-free的物品时必须戴手套。
1、 料制品的处理 尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明rnase-free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入depc使depc的终浓度为0.1%。注意：depc为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入depc水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将depc水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已depc水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。
2、 璃玻和金属物品 250°c烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总rna
1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml trizol加入trizol，转入离心管进行第2步操作。
2) 匀浆：组织样品按50-100mg/mltrizol 加入trizol。另外，组织体积不能超过trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。
五、从细胞中提取总rna
1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用trizol进行消化、裂解，trizol
体积按10cm2
/ml比例加入。
2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。
六、操作步骤
1、细胞或组织加trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃*保持。
2、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。
3、按200ul氯fang/ml trizol加入氯fang，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组dna断裂。
4、4℃ 12,000g离心15min。
5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取dna和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提rna，则弃下层酚相。
6、按0.5ml异丙醇/ml trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。
7、4℃ 12,000g离心10min，弃上清，rna沉于管底。
8、按1ml 75%乙醇/ml trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、 4℃ 8,000g离心5min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥5-10min。 注：rna样品不要过于干燥，否则很难溶解。
11、可用50ul h2o，te buffer或0.5%sds溶解rna样品，55-60℃,5-10min。
注：h2o、te或0.5%sds均须用depc处理并高压。
12、测o.d值定量rna浓度。注：此方法提取rna a260/a280值在1.6-1.8之间；产率估计：组织标本：（ug rna/mg组织）1-10ug，培养细胞（ugrna/106cell）：5-15ug。
注：组织或细胞量过少，可酌情减少trizol用量；组织或细胞用量过多，会引起dna对rna的污染；
高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4℃ 12,000g离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉；
热天提rna，带手套是必须的，手是rnase的主要来源；
组织块用液氮研磨，效果，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用*将组织碱碱剪碎，然后再充分研磨。
6.1.2.1 肝脏、肠道、肌肉总rna提取方法
①使用已高温蒸汽灭菌的*和镊子从鱼的腹部解剖开，从中取出完整的肝脏、肠、肌肉等组织，置于离心管后立即放入液氮中；
②组织在液氮下研磨成粉，取少量至加有1mltrizol的1.5ml离心管中，充分混合后于4℃，12,000rpm离心15min；
③取上清移至新1.5ml离心管中，加入200ul氯fang，剧烈震荡直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm离心15min；
④取上清移至新1.5ml离心管中，加入500ul异丙醇，轻轻颠倒10次，冰上放置20mins，于4℃，12,000rpm离心15min；
⑤弃上清，加入1ml75%乙醇（用depc水现配现用），于4℃，12000rpm离心5min，重复此步骤一次；
⑥弃上清后，室温干燥5-7mins；
⑦加入适量（20-30ul）的depc水溶解沉淀65℃溶解，-20℃（-80℃）保存，检测rna浓度，并电泳检测。
6.1.2.2 rna浓度测定和电泳检测
取2ul提取好的rna溶液，于nanodrop 2000 spectrophptpmeter测定rna浓度及a260/a280的相对吸光度，纯净rna的a260/a280应在1.8-2.2之间。
电泳检测：1%琼脂糖，1×ate缓冲液，90v电泳30min，凝胶成像系统观察，分析结果。
6.1.2.3 肝脏、肌肉、肠道样品cdna的合成
反应按照takara公司的primescript® rt reagent kit with gdna eraser（perfect real time) 反转录试剂盒说明书进行，合成cdna模板。
①基因组dna的除去反应，在pcr管中配置如下缓冲液。
试剂 用量
5×gdna eraser buffer 2.0 μl
gdna eraser 1.0 μl
total rna x* ul
rnase free dh2o up to 10 μl
x*：根据检测到的rna浓度来配置； 混合均匀后，室温放置20-30min
②反转录反应，在pcr管中配置如下缓冲液（20ul system），反应液配制在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先按反应数+1的量配制master mix ，然后再分装到每个反应管中。
试剂 使用量
5×primescript® buffer 2（for realtime） 4.0 ul
primescript® rt enzyme mix i 1.0 μl
rt primer mix 1.0 μl
①的反应液 10.0 ul
rnase free dh2o up to 20 μl
③混合均匀后，在pcr仪上进行逆转录反应，反应条件为：
37℃ 15 min 85℃ 5 sec
然后将得到的cdna存放于-20℃冰箱保存待用。
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二、试剂和材料
无水乙醇、氯fang、glycogen（可能需要）、 1.5ml eppendorf管（rnase-free）、 tips（rnase-free）
三、准备工作
rnase酶非常稳定，是导致rna降解zui主要的物质。它在一些的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是rnase*失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与rna制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。 rnase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用depc配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取rnase-free的物品时必须戴手套。
1、 料制品的处理 尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明rnase-free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入depc使depc的终浓度为0.1%。注意：depc为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入depc水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将depc水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已depc水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。
2、 璃玻和金属物品 250°c烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总rna
1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml trizol加入trizol，转入离心管进行第2步操作。
2) 匀浆：组织样品按50-100mg/mltrizol 加入trizol。另外，组织体积不能超过trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。
五、从细胞中提取总rna
1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用trizol进行消化、裂解，trizol
体积按10cm2
/ml比例加入。
2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。
六、操作步骤
1、细胞或组织加trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃*保持。
2、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。
3、按200ul氯fang/ml trizol加入氯fang，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组dna断裂。
4、4℃ 12,000g离心15min。
5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取dna和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提rna，则弃下层酚相。
6、按0.5ml异丙醇/ml trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。
7、4℃ 12,000g离心10min，弃上清，rna沉于管底。
8、按1ml 75%乙醇/ml trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、 4℃ 8,000g离心5min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥5-10min。 注：rna样品不要过于干燥，否则很难溶解。
11、可用50ul h2o，te buffer或0.5%sds溶解rna样品，55-60℃,5-10min。
注：h2o、te或0.5%sds均须用depc处理并高压。
12、测o.d值定量rna浓度。注：此方法提取rna a260/a280值在1.6-1.8之间；产率估计：组织标本：（ug rna/mg组织）1-10ug，培养细胞（ugrna/106cell）：5-15ug。
注：组织或细胞量过少，可酌情减少trizol用量；组织或细胞用量过多，会引起dna对rna的污染；
高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4℃ 12,000g离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉；
热天提rna，带手套是必须的，手是rnase的主要来源；
组织块用液氮研磨，效果，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用*将组织碱碱剪碎，然后再充分研磨。
6.1.2.1 肝脏、肠道、肌肉总rna提取方法
①使用已高温蒸汽灭菌的*和镊子从鱼的腹部解剖开，从中取出完整的肝脏、肠、肌肉等组织，置于离心管后立即放入液氮中；
②组织在液氮下研磨成粉，取少量至加有1mltrizol的1.5ml离心管中，充分混合后于4℃，12,000rpm离心15min；
③取上清移至新1.5ml离心管中，加入200ul氯fang，剧烈震荡直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm离心15min；
④取上清移至新1.5ml离心管中，加入500ul异丙醇，轻轻颠倒10次，冰上放置20mins，于4℃，12,000rpm离心15min；
⑤弃上清，加入1ml75%乙醇（用depc水现配现用），于4℃，12000rpm离心5min，重复此步骤一次；
⑥弃上清后，室温干燥5-7mins；
⑦加入适量（20-30ul）的depc水溶解沉淀65℃溶解，-20℃（-80℃）保存，检测rna浓度，并电泳检测。
6.1.2.2 rna浓度测定和电泳检测
取2ul提取好的rna溶液，于nanodrop 2000 spectrophptpmeter测定rna浓度及a260/a280的相对吸光度，纯净rna的a260/a280应在1.8-2.2之间。
电泳检测：1%琼脂糖，1×ate缓冲液，90v电泳30min，凝胶成像系统观察，分析结果。
6.1.2.3 肝脏、肌肉、肠道样品cdna的合成
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①基因组dna的除去反应，在pcr管中配置如下缓冲液。
试剂 用量
5×gdna eraser buffer 2.0 μl
gdna eraser 1.0 μl
total rna x* ul
rnase free dh2o up to 10 μl
x*：根据检测到的rna浓度来配置； 混合均匀后，室温放置20-30min
②反转录反应，在pcr管中配置如下缓冲液（20ul system），反应液配制在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先按反应数+1的量配制master mix ，然后再分装到每个反应管中。
试剂 使用量
5×primescript® buffer 2（for realtime） 4.0 ul
primescript® rt enzyme mix i 1.0 μl
rt primer mix 1.0 μl
①的反应液 10.0 ul
rnase free dh2o up to 20 μl
③混合均匀后，在pcr仪上进行逆转录反应，反应条件为：
37℃ 15 min 85℃ 5 sec
然后将得到的cdna存放于-20℃冰箱保存待用。
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便携式生物气溶胶采样器是捕捉微生物的重要工具
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