百萤-Annexin V-iFluor 350标记实验方案
annexin v-ifluor 350标记是美国aat bioquest研发的用于检测细胞功能的探针，膜联蛋白是钙依赖性磷脂结合蛋白家族。 我们的膜联蛋白v结合物是一组监测细胞功能的工具，旨在通过测量磷脂酰*氨酸的易位来监测细胞凋亡。百萤生物是aat bioquest的中国代理商，为您提供优质的annexin v-ifluor 350检测试剂。
适用仪器
流式细胞仪
ex:355 nm
em：450/50 nm
通道:pacific blue
荧光显微镜
推荐孔板:黑色透明底板
通道:pacific blue 通道
实验方案
分析方案
概述
用测试化合物（200μl/样品）制备细胞
添加annexin v结合物测定溶液
室温孵育30-60分钟
用流式细胞仪或荧光显微镜分析
1.用膜联蛋白v缀合物制备和孵育细胞：
1.1制备膜联蛋白v结合测定缓冲液：10mm hepes，140mm nacl和2.5mm cacl2，ph 7.4。
1.2用测试化合物处理细胞一段所需的时间（用星形孢菌素处理的jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。
1.3离心细胞，得到1-5×105个细胞/管。
1.4将细胞重悬于200μl膜联蛋白v结合测定缓冲液中（来自步骤1.1）。
1.5在细胞中加入2μl膜联蛋白v结合物。
可选：在细胞内加入死细胞染色剂如碘化丙锭，用于坏死细胞。
1.6在室温下孵育30至60分钟，避光。
1.7在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，加入300μl膜联蛋白v结合测定缓冲液（来自步骤1.1）以增加体积（参见下面的步骤1.8）。
1.8使用流式细胞仪或荧光显微镜监测荧光强度（参见下面的步骤2或3）。
2.使用流式细胞仪分析：
通过使用具有适当过滤器的流式细胞仪来量化膜联蛋白v缀合物。
注意：粘附细胞上的膜联蛋白v结合流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。 然而，casiola-rosen等人先前报道了利用膜联蛋白v对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。 和van engelend等人（见参考文献1和2）。
3.使用荧光显微镜分析：
3.1移取步骤1.6的细胞悬液，用膜联蛋白v结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，然后用膜联蛋白v结合测定缓冲液（来自步骤1.1）重悬细胞。 将细胞添加到盖有玻璃盖玻片的载玻片上。
注意：对于粘附细胞，建议直接在盖玻片上生长细胞。 与膜联蛋白v缀合物孵育（步骤1.6）后，用膜联蛋白v结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，并将膜联蛋白v结合测定缓冲液（来自步骤1.1）加回到盖玻片中。 在玻璃载玻片上翻转盖玻片并观察细胞。 在与膜联蛋白v缀合物孵育后，细胞也可以在2％甲醛中固定，并在显微镜下观察。
3.2在荧光显微镜下用适当的滤光片分析膜联蛋白v缀合物的凋亡细胞
数据分析
下图是使用流式细胞仪检测膜联蛋白v-mfluor violet 450与磷脂酰*氨酸在jurkat细胞凋亡中的结合活性的实例。 在活的非凋亡细胞中，膜联蛋白v-mfluor violet 450检测非诱导细胞中的先天性细胞凋亡，其通常为所有细胞的2-6％。 在凋亡细胞中，膜联蛋白v-mfluor violet 450与磷脂酰*氨酸结合，磷脂酰*氨酸位于细胞膜的外部小叶上，导致染色强度增加。
图1.在jurkat细胞中检测膜联蛋白vmfluor violet 450和磷脂酰*氨酸的结合活性。 将jurkat细胞在37℃，5％co2培养箱中不用（蓝色）或用1μm星形孢菌素（红色）处理5小时，然后用annexin v-mfluor violet 450染色30分钟。 使用facscalibur（becton dickinson，san jose，ca）流式细胞仪，使用紫外激光在ex / em = 405 / 450nm下测量膜联蛋白v-mfluor violet 450的荧光强度。
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适用仪器
流式细胞仪
ex:355 nm
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通道:pacific blue
荧光显微镜
推荐孔板:黑色透明底板
通道:pacific blue 通道
实验方案
分析方案
概述
用测试化合物（200μl/样品）制备细胞
添加annexin v结合物测定溶液
室温孵育30-60分钟
用流式细胞仪或荧光显微镜分析
1.用膜联蛋白v缀合物制备和孵育细胞：
1.1制备膜联蛋白v结合测定缓冲液：10mm hepes，140mm nacl和2.5mm cacl2，ph 7.4。
1.2用测试化合物处理细胞一段所需的时间（用星形孢菌素处理的jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。
1.3离心细胞，得到1-5×105个细胞/管。
1.4将细胞重悬于200μl膜联蛋白v结合测定缓冲液中（来自步骤1.1）。
1.5在细胞中加入2μl膜联蛋白v结合物。
可选：在细胞内加入死细胞染色剂如碘化丙锭，用于坏死细胞。
1.6在室温下孵育30至60分钟，避光。
1.7在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，加入300μl膜联蛋白v结合测定缓冲液（来自步骤1.1）以增加体积（参见下面的步骤1.8）。
1.8使用流式细胞仪或荧光显微镜监测荧光强度（参见下面的步骤2或3）。
2.使用流式细胞仪分析：
通过使用具有适当过滤器的流式细胞仪来量化膜联蛋白v缀合物。
注意：粘附细胞上的膜联蛋白v结合流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。 然而，casiola-rosen等人先前报道了利用膜联蛋白v对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。 和van engelend等人（见参考文献1和2）。
3.使用荧光显微镜分析：
3.1移取步骤1.6的细胞悬液，用膜联蛋白v结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，然后用膜联蛋白v结合测定缓冲液（来自步骤1.1）重悬细胞。 将细胞添加到盖有玻璃盖玻片的载玻片上。
注意：对于粘附细胞，建议直接在盖玻片上生长细胞。 与膜联蛋白v缀合物孵育（步骤1.6）后，用膜联蛋白v结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，并将膜联蛋白v结合测定缓冲液（来自步骤1.1）加回到盖玻片中。 在玻璃载玻片上翻转盖玻片并观察细胞。 在与膜联蛋白v缀合物孵育后，细胞也可以在2％甲醛中固定，并在显微镜下观察。
3.2在荧光显微镜下用适当的滤光片分析膜联蛋白v缀合物的凋亡细胞
数据分析
下图是使用流式细胞仪检测膜联蛋白v-mfluor violet 450与磷脂酰*氨酸在jurkat细胞凋亡中的结合活性的实例。 在活的非凋亡细胞中，膜联蛋白v-mfluor violet 450检测非诱导细胞中的先天性细胞凋亡，其通常为所有细胞的2-6％。 在凋亡细胞中，膜联蛋白v-mfluor violet 450与磷脂酰*氨酸结合，磷脂酰*氨酸位于细胞膜的外部小叶上，导致染色强度增加。
图1.在jurkat细胞中检测膜联蛋白vmfluor violet 450和磷脂酰*氨酸的结合活性。 将jurkat细胞在37℃，5％co2培养箱中不用（蓝色）或用1μm星形孢菌素（红色）处理5小时，然后用annexin v-mfluor violet 450染色30分钟。 使用facscalibur（becton dickinson，san jose，ca）流式细胞仪，使用紫外激光在ex / em = 405 / 450nm下测量膜联蛋白v-mfluor violet 450的荧光强度。
关键词：显微镜 培养箱 流式细胞仪 荧光显微镜
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