蛋白快速银染试剂盒的背景与应用及操作步骤！
蛋白快速银染试剂盒的背景与应用及操作步骤！
一、背景
蛋白快速银染试剂盒是一种快速的可用于sds-page或非变性page等蛋白银染染色的试剂盒，该试剂盒含有增敏步骤，可明显降低背景。
其优点还在于：
1、操作简单、快速；
2、可用于2d凝胶的银染，并可进行后续的质朴检测；
3、目的条带清晰；
4、不含甲醇。protein fast silver stain kit与protein silver stain kit相比，前者操作速度更快，但检测灵敏度可能低于后者，尤其是在检测小分子量蛋白质的时候。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
二、蛋白快速银染试剂盒操作步骤
1、准备工作：以下操作以8.5×5.5cm、厚度为1.0mm的凝胶为例，以凝胶全部浸没到溶液为准，一般用量是25ml，对于凝胶体积较大的，各溶液的使用量需按凝胶体积比例放大。整个银染过程应在摇床上进行，摇床转速控制在60～70rpm。提前配制固定液，即按无水乙醇:冰乙酸:去离子水=5:1:4的比例配制。提前配制洗涤液，即按无水乙醇:去离子水=1:4的比例配制。
2、水洗：电泳结束后，取凝胶放入去离子水中清洗2次，每次5min。
3、固定：取凝胶放入50～100ml固定液中，在摇床上室温摇动15～20min，重复固定步骤1次。
4、洗脱：取凝胶放入洗涤液中清洗2次，每次5min。
5、水洗：去离子水清洗凝胶2次，每次5min。
6、增敏：配制银染增敏工作液，即取silver stain sensitizer(500×)0.1ml加入到50ml去离子水中，混匀，即1×silver stain sensitizer，一般应2h内用完。室温下用1×silver stain sensitizer孵育凝胶2min，立即用去离子水清洗凝胶2次，每次1min。
7、银染：配制银染工作液，即取silver stain(100×)0.5ml加入到50ml去离子水中，混匀，即得1×silver stain，一般应2h内用完。取凝胶入1×silver stain，在摇床上室温摇动10～20min。
8、水洗：弃液，在摇床上用去离子水清洗凝胶2次，每次30s，摇动速度在60～70rpm。总的水洗时间应控制在1.5min内。
9、显影：配制银染显影工作液，即取silver stain developer(5×)10ml加入到40ml去离子水中，混匀，即1×silver stain developer，一般应30min内用完。清洗凝胶后，立即置于1×silver stain developer中，室温孵育2～10min，直至蛋白条带清晰可见。一般显色30s后就会出现棕色沉淀，继续显影2～3min，亦可延长至5min以上，如果显影效果不佳，可重新更换1×silver stain developer继续显影。
10、迅速用去离子水清洗凝胶以避免显影过度，背景染色。立即加入银染终止液，摇床上摇动10min，以终止显色反应。(配制银染终止液，即取silver stain stop buffer(10×)10ml加入到90ml去离子水中，混匀，即1×silver stain stop buffer，一般应24h内用完。)
11、保存：弃终止液，加入去离子水50ml，摇床上摇动2～5min，弃液。短期保存于新鲜去离子水，长期保存可以制备干胶。
三、应用
蛋白快速银染试剂盒可以用于苦杏仁蛋白组分鉴别方法研究：
研究苦杏仁(semen armeniacae amarum)信息物质——可溶性蛋白组分,建立苦杏仁蛋白组分的鉴定方法,为中药信息物质组分鉴定学的建立提供科学数据和技术。
研究内容和方法：
1、总蛋白的含量测定采用bradford法。对苦杏仁类药材、饮片及其不同制剂条件下的可溶性总蛋白进行了含量测定。
2、苦杏仁蛋白的电泳鉴定方法研究采用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。包括对苦杏仁类中药sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳条件(上样量、凝胶浓度、胶片规格、染色方法、脱色程度、凝胶类型)的优选、谱带特征分析、谱带分子量计算、鉴别方法的考察与确定、电泳图谱分析与电泳图谱聚类分析等。
3、苦杏仁类中药sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别方法的适用性研究分别对炮制品(饮片)和不同入药方式剂型的适用性、鉴别方法的可重复性进行了研究。
研究结果：
1、苦杏仁类中药总蛋白含量变化规律为:炒制品<生品<燀制品，含量分别为:苦杏仁:杏(prunus armeniaca l.)(6.76%,11.53%,13.54%);山杏(prunus armeniaca l.var.ansu maxim.)(6.18%,9.67%,14.62%)。桃仁:山桃(prunus davidiana(carr.)franch.)(9.75%,16.81%,17.90%);桃(prunus persica(l.)batsch)(9.59%,17.75%,16.28%);甜杏仁:李光杏(a.vularis var.glabras.x.sun)(7.52%,11.88%,12.73%)。
2、苦杏仁类中药sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳条件为:凝胶浓度:浓缩胶c=2.6%,t=3.9%;分离胶c=2.6%,t=12%;上样量:20μg(考马斯亮蓝r-250染色),10μg(银染色);恒压电泳u=150v;冷凝回流条件下电泳时。
3、确定苦杏仁类中药sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带特征:结合考马斯亮蓝染色和银染色结果,蔷薇科李属的9个种子类供试品,sds蛋白电泳图共得到39条迁移率不同的谱带,按分子量大小不同,可大致划分为三个特征区组,即高分子量组a(60 kda105 kda)、中分子量组b(29 kda59 kda)和低分子量组c(10 kda28 kda)。其中各供试品在b、c组内均有34条高含量谱带,此二组谱带的具体数目、位置及深浅度显示明显差异,具有鉴别意义。具体鉴别特征的应用可通过分种检索表形式加以实现。
4、得到苦杏仁类中药sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱:电泳图谱中特征峰主要集中在44 kda 55 kda和21 kda 24 kda两区域内,为苦杏仁类供试品电泳图谱的共有特征;而各供试品在此两组特征峰处的具体峰数目、位置和峰强显示出明显差异,为苦杏仁类供试品电泳图谱的主要鉴别特征区。
5、蛋白质电泳图谱聚类分析结果与植物系统分类基本一致。
6、炮制和制剂过程对苦杏仁类中药sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳高含量谱带影响不显著。因此,在中药品种层次上,炮制方法的改变,或一般制剂工艺过程理论上不影响对中药饮片蛋白组分的鉴别。对具体含苦杏仁中药的制剂的电泳鉴别方法的实践表明:在单制剂中蛋白电泳鉴别法可行,且不受炮制过程影响;在复杂制剂中,可用于桃仁杏仁来源中药的鉴别。
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一、背景
蛋白快速银染试剂盒是一种快速的可用于sds-page或非变性page等蛋白银染染色的试剂盒，该试剂盒含有增敏步骤，可明显降低背景。
其优点还在于：
1、操作简单、快速；
2、可用于2d凝胶的银染，并可进行后续的质朴检测；
3、目的条带清晰；
4、不含甲醇。protein fast silver stain kit与protein silver stain kit相比，前者操作速度更快，但检测灵敏度可能低于后者，尤其是在检测小分子量蛋白质的时候。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
二、蛋白快速银染试剂盒操作步骤
1、准备工作：以下操作以8.5×5.5cm、厚度为1.0mm的凝胶为例，以凝胶全部浸没到溶液为准，一般用量是25ml，对于凝胶体积较大的，各溶液的使用量需按凝胶体积比例放大。整个银染过程应在摇床上进行，摇床转速控制在60～70rpm。提前配制固定液，即按无水乙醇:冰乙酸:去离子水=5:1:4的比例配制。提前配制洗涤液，即按无水乙醇:去离子水=1:4的比例配制。
2、水洗：电泳结束后，取凝胶放入去离子水中清洗2次，每次5min。
3、固定：取凝胶放入50～100ml固定液中，在摇床上室温摇动15～20min，重复固定步骤1次。
4、洗脱：取凝胶放入洗涤液中清洗2次，每次5min。
5、水洗：去离子水清洗凝胶2次，每次5min。
6、增敏：配制银染增敏工作液，即取silver stain sensitizer(500×)0.1ml加入到50ml去离子水中，混匀，即1×silver stain sensitizer，一般应2h内用完。室温下用1×silver stain sensitizer孵育凝胶2min，立即用去离子水清洗凝胶2次，每次1min。
7、银染：配制银染工作液，即取silver stain(100×)0.5ml加入到50ml去离子水中，混匀，即得1×silver stain，一般应2h内用完。取凝胶入1×silver stain，在摇床上室温摇动10～20min。
8、水洗：弃液，在摇床上用去离子水清洗凝胶2次，每次30s，摇动速度在60～70rpm。总的水洗时间应控制在1.5min内。
9、显影：配制银染显影工作液，即取silver stain developer(5×)10ml加入到40ml去离子水中，混匀，即1×silver stain developer，一般应30min内用完。清洗凝胶后，立即置于1×silver stain developer中，室温孵育2～10min，直至蛋白条带清晰可见。一般显色30s后就会出现棕色沉淀，继续显影2～3min，亦可延长至5min以上，如果显影效果不佳，可重新更换1×silver stain developer继续显影。
10、迅速用去离子水清洗凝胶以避免显影过度，背景染色。立即加入银染终止液，摇床上摇动10min，以终止显色反应。(配制银染终止液，即取silver stain stop buffer(10×)10ml加入到90ml去离子水中，混匀，即1×silver stain stop buffer，一般应24h内用完。)
11、保存：弃终止液，加入去离子水50ml，摇床上摇动2～5min，弃液。短期保存于新鲜去离子水，长期保存可以制备干胶。
三、应用
蛋白快速银染试剂盒可以用于苦杏仁蛋白组分鉴别方法研究：
研究苦杏仁(semen armeniacae amarum)信息物质——可溶性蛋白组分,建立苦杏仁蛋白组分的鉴定方法,为中药信息物质组分鉴定学的建立提供科学数据和技术。
研究内容和方法：
1、总蛋白的含量测定采用bradford法。对苦杏仁类药材、饮片及其不同制剂条件下的可溶性总蛋白进行了含量测定。
2、苦杏仁蛋白的电泳鉴定方法研究采用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。包括对苦杏仁类中药sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳条件(上样量、凝胶浓度、胶片规格、染色方法、脱色程度、凝胶类型)的优选、谱带特征分析、谱带分子量计算、鉴别方法的考察与确定、电泳图谱分析与电泳图谱聚类分析等。
3、苦杏仁类中药sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别方法的适用性研究分别对炮制品(饮片)和不同入药方式剂型的适用性、鉴别方法的可重复性进行了研究。
研究结果：
1、苦杏仁类中药总蛋白含量变化规律为:炒制品<生品<燀制品，含量分别为:苦杏仁:杏(prunus armeniaca l.)(6.76%,11.53%,13.54%);山杏(prunus armeniaca l.var.ansu maxim.)(6.18%,9.67%,14.62%)。桃仁:山桃(prunus davidiana(carr.)franch.)(9.75%,16.81%,17.90%);桃(prunus persica(l.)batsch)(9.59%,17.75%,16.28%);甜杏仁:李光杏(a.vularis var.glabras.x.sun)(7.52%,11.88%,12.73%)。
2、苦杏仁类中药sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳条件为:凝胶浓度:浓缩胶c=2.6%,t=3.9%;分离胶c=2.6%,t=12%;上样量:20μg(考马斯亮蓝r-250染色),10μg(银染色);恒压电泳u=150v;冷凝回流条件下电泳时。
3、确定苦杏仁类中药sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带特征:结合考马斯亮蓝染色和银染色结果,蔷薇科李属的9个种子类供试品,sds蛋白电泳图共得到39条迁移率不同的谱带,按分子量大小不同,可大致划分为三个特征区组,即高分子量组a(60 kda105 kda)、中分子量组b(29 kda59 kda)和低分子量组c(10 kda28 kda)。其中各供试品在b、c组内均有34条高含量谱带,此二组谱带的具体数目、位置及深浅度显示明显差异,具有鉴别意义。具体鉴别特征的应用可通过分种检索表形式加以实现。
4、得到苦杏仁类中药sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱:电泳图谱中特征峰主要集中在44 kda 55 kda和21 kda 24 kda两区域内,为苦杏仁类供试品电泳图谱的共有特征;而各供试品在此两组特征峰处的具体峰数目、位置和峰强显示出明显差异,为苦杏仁类供试品电泳图谱的主要鉴别特征区。
5、蛋白质电泳图谱聚类分析结果与植物系统分类基本一致。
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