TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和经验总结
一、tunel法的实验原理
细胞凋亡中,染色体dna双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-oh末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（tdt）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生，物，素形成的衍生物标记到dna的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,tunel）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有dna的断裂，因而没有3'-oh形成，很少能够被染色。由此，tunel成为了检测dn段化（细胞凋亡）的方法。（以下是tunel法细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光））
tunel检测：使用10 u/ml dnase处理hela细胞10分钟
二、tunel实验中关键步骤
1.充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60ºc 20 min，再用使用二甲苯两次5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；
2.把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10-30 min，几μm切片用短时间；几十μm切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3.适当延长tunel反应液的时间。一般是37ºc 1 h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2 h，但要结合你终的背景着色。
4.dab显色条件的选择。一般dab反应10 min左右，结合镜下控制背景颜色，长不超过30 min；promega公司提供的dab液（桃红色），不利于辨认棕褐色，我不太喜欢。
5.pbs的充分清洗。我个人认为，在tunel反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定后切片的非特异性着色。
6.此外，内源性pod的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响终的特异性染色。
三、细胞通透的时间选择
1.蛋白酶k的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。但浓度过高或孵育时间太长容易脱片，只要不脱片，好像影响不大，其作用类似与tritonx100等细胞通透剂。
2.蛋白酶k一般工作液浓度为20μg/ml,但浓缩液可配制1-10 mg/ml，可用pbs配制，也可用蛋白酶k缓冲液（100 mm tris hcl ph8.0+50 mm edta）；然后分装成小份，用完一支再用下一支，-20ºc保存1个月应该没问题的（重复拿的那支），而一直冷冻的至少可以用半年以上。
3.蛋白酶k反应时间一般为10-30 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4μm左右的片子可以用10 min，但30μm左右的可用30 min，终通过摸索时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。
关键试剂操作条件
dab显色反应大约需要10 min，要控制好反应时间，勿使背景颜色过深。具体的可能还是得根据切片组织来源和切片厚度、试剂盒种类不同来摸索一下。
蛋白酶k工作液处理时间、温度须在范围内摸索，温度过高，时间过长，易破坏核酸结构，出现假阳性。
dnase 1一般室温，10 min即可。
四、如何减弱非特异性染色
若是肝脏或肾脏，因富含内源性过氧化物酶，需要增加过氧化氢浓度和延长孵育时间。其他还可以加强灭活、缩短dab孵育时间、pbs充分清洗，注意镜下把握好着色。
tips
1.湿盒用带盖方盘，里面固定几根玻璃吸管用于放玻片，使用时稍加水即可。
2.英文说明书中对组织细胞通透这一步中，加了“对难处理的组织的处理”，意思是用常规方法处理（如蛋白酶k)后，应该阳性而做不出阳性时，可用微波修复。
3.复染的目的是为了衬托组织形态结构，以利于结果分析，石蜡切片常用苏木素，核染成兰色，冷冻切片常用甲基绿，核染成绿色。
4.pbs用蒸馏水、na2hpo4、kh2po4配制，现在有卖的，自己加蒸馏水稀释后即可用，很方便，也不贵。
5.蛋白酶k消化蛋白后，需要用封闭液。
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二、tunel实验中关键步骤
1.充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60ºc 20 min，再用使用二甲苯两次5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；
2.把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10-30 min，几μm切片用短时间；几十μm切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3.适当延长tunel反应液的时间。一般是37ºc 1 h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2 h，但要结合你终的背景着色。
4.dab显色条件的选择。一般dab反应10 min左右，结合镜下控制背景颜色，长不超过30 min；promega公司提供的dab液（桃红色），不利于辨认棕褐色，我不太喜欢。
5.pbs的充分清洗。我个人认为，在tunel反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定后切片的非特异性着色。
6.此外，内源性pod的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响终的特异性染色。
三、细胞通透的时间选择
1.蛋白酶k的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。但浓度过高或孵育时间太长容易脱片，只要不脱片，好像影响不大，其作用类似与tritonx100等细胞通透剂。
2.蛋白酶k一般工作液浓度为20μg/ml,但浓缩液可配制1-10 mg/ml，可用pbs配制，也可用蛋白酶k缓冲液（100 mm tris hcl ph8.0+50 mm edta）；然后分装成小份，用完一支再用下一支，-20ºc保存1个月应该没问题的（重复拿的那支），而一直冷冻的至少可以用半年以上。
3.蛋白酶k反应时间一般为10-30 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4μm左右的片子可以用10 min，但30μm左右的可用30 min，终通过摸索时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。
关键试剂操作条件
dab显色反应大约需要10 min，要控制好反应时间，勿使背景颜色过深。具体的可能还是得根据切片组织来源和切片厚度、试剂盒种类不同来摸索一下。
蛋白酶k工作液处理时间、温度须在范围内摸索，温度过高，时间过长，易破坏核酸结构，出现假阳性。
dnase 1一般室温，10 min即可。
四、如何减弱非特异性染色
若是肝脏或肾脏，因富含内源性过氧化物酶，需要增加过氧化氢浓度和延长孵育时间。其他还可以加强灭活、缩短dab孵育时间、pbs充分清洗，注意镜下把握好着色。
tips
1.湿盒用带盖方盘，里面固定几根玻璃吸管用于放玻片，使用时稍加水即可。
2.英文说明书中对组织细胞通透这一步中，加了“对难处理的组织的处理”，意思是用常规方法处理（如蛋白酶k)后，应该阳性而做不出阳性时，可用微波修复。
3.复染的目的是为了衬托组织形态结构，以利于结果分析，石蜡切片常用苏木素，核染成兰色，冷冻切片常用甲基绿，核染成绿色。
4.pbs用蒸馏水、na2hpo4、kh2po4配制，现在有卖的，自己加蒸馏水稀释后即可用，很方便，也不贵。
5.蛋白酶k消化蛋白后，需要用封闭液。
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