His 融合蛋白纯化常见问题解答
蛋白过镍柱纯化的原理：ni-nta 纯化介质纯化带有 his6-tag 的融合蛋白是目前蛋白纯化中zui常使用的一种方法。ni 柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有 his(组蛋白) 标签的碱性蛋白蛋白结合，组蛋白标签一般是 6 个* (碱性氨基酸)。在蛋白上样后，带有*标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。ni 柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合，采用咪唑洗脱，咪唑竞争性结合到硫酸镍上，目的蛋白就被洗脱了，这时候收集穿出液，里面就是目的蛋白，然后透析掉咪唑即可。 上样，清洗，洗脱，基本三个步骤就结束了。
ni-nta 常见问题及建议
1. his 标签蛋白没有与柱结合：
a. 可能原因：超声的功率不对 ( 太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放)。
解决方法：改变超声功率，并在超声前加入*。
b. 可能原因：样品或者是结合缓冲液不正确。
解决方法：检测 ph 及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。
c. 可能原因：*标签暴露不*。
解决方法：在变性条件下 ( 用 4-8 m 脲，或 4-6 m 盐酸胍) 进行纯化。
d. 可能原因：his 标签丢失。
解决方法 1：wb 检查 his 是否表达，上游构建，改变 his-tag 的位置 (c- 端或 n- 端)，必要时增加 his 个数。
解决方法 2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。
解决方法 3：改变螯合的金属离子，寻找到*的结合金属离子。
ni2+ 通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数 6×his 标记的重组蛋白质的选金属离子。也是一般zui常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 ph，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 ni2+。
2. his 标签蛋白没有被洗脱下来：
a. 可能原因：洗脱条件太温和 （*标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）。
解决方法：增加咪唑的梯度洗脱或降低 ph 来找出*的洗脱条件。
b. 可能原因：降低 ph 的方法洗脱的，若 ph 低于 3.5，会导致镍离子脱落。
解决方法：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱。
c. 可能原因：蛋白已沉淀在柱上。
解决方法： 减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变 nacl 的浓度，或在变性条件 ( 去折叠) 下洗脱 ( 用 4～8 m 脲，或 4～6 m 盐酸胍)。
d. 可能原因：非特异性疏水或其他相互反应。
解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液 (如：2% triton x-100) 或增加 nacl 的浓度。
3. his 标签蛋白洗脱后杂带较多
a. 可能原因：蛋白酶部分降解了标签蛋白。
解决方法：添加蛋白酶抑制剂。
b. 可能原因：杂质对镍离子有更高的亲和性。
解决方法 1：咪唑浓度必须优化，以确保高纯度 ( 宿主细胞蛋白质的低结合) 和高产率 ( *标记的目标蛋白质的强结合) 之间的*平衡。分步或者线性洗脱摸索出*的咪唑结合和清洗浓度; 在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑; 咪唑的梯度不大 (20 个或更多的柱床体积)，可能分离出有相似结合强度的蛋白。
解决方法 2：筛选的缓冲液条件，nacl 浓度，ph 的范围都需要进行筛选。对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时，将缓冲液、盐、甘油和还原剂设计成不同的混合配方来进行优化。
解决方法 3：若以上优化的条件都不能去除杂质蛋白，需要考虑多步纯化的思路，如利用 strep 标签进行两步纯化或采用 subtractive method 进行纯化。
c. 可能原因：杂质和标签蛋白结合在一起。
解决方法：在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂; 增加去垢剂的浓度 ( 2% triton x-100 or 2% tween 20); 或者在 wash buffer 中增加甘油的浓度 (50%) 减少非特异性的相互反应; 考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子。
d. 可能原因：洗涤不充分。
解决方法：增加洗涤的次数，使洗涤充分。
4. 使用几次后 ni 柱载量下降，挂柱效率低，如何处理？
可能原因：逐渐积累沉淀，变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点，而通过洗脱液无法*清洗所致。
较温和的清洗方法： 用 2 倍柱体积的 6m 盐酸胍或 8m 尿素洗涤，然后用 5 倍体积的缓冲液洗涤，以去除沉淀或变性物质。用 2 倍柱体积的 1% triton x-100 洗涤，然后用 5 倍柱体积的缓冲液洗涤，以去除疏水结合的物质。若改变不明显，可选择强烈清洗方式。
强烈清洗方式： 首先用 5－10 倍柱体积的脱镍缓冲液（20 mm 磷酸钠， 0.5 m nacl，50 mm edta， ph 7.4）洗涤，迚行脱镍操作，然后用 5～10 倍柱体积的平衡缓冲液冲洗，zui后用 5－10 倍柱体积的双蒸水冲洗；随后进行清洗操作，去除离子型杂蛋白，可以用 5 倍柱体积的 1.5 m nacl 溶液，然后 10 倍柱体积的双蒸水冲洗；去除沉淀或变性蛋白，可以用 1m 氢氧化钠溶液，结合 1～2 小时，然后用 10 倍柱体积的平衡缓冲液和 10 倍柱体积的双蒸水迚行冲洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用 5－10 倍柱体积的 30% 异丙醇溶液清洗，然后 10 倍柱体积的双蒸水洗涤；zui后进行生镍操作，用 0.1m 硫酸镍上柱，随后 5 倍柱体积的双蒸水和平衡缓冲液迚行洗涤，如需保存，保存在 20% 乙醇溶液。
5. 镍柱使用中出现棕色是怎么回事?
可能原因：缓冲液中 dtt 的影响， dtt 会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响, 在碱性的缓冲液条件下，镍离子会被 dtt 还原生成棕色的沉淀，所以要尽量避免 dtt 的参与。
因此，若您的样品中含有 dtt，在上样之前, 我们*采用不含还原性试剂的空白运行来除去任何较弱结合的镍离子；空白运行方法（使用不含还原剂的平衡液和洗脱液）1）5 倍柱体积的双蒸水洗柱 ；2）5 倍柱体积的平衡液洗柱；3）5 倍柱体积的洗脱液洗柱；4）10 倍柱体积的平衡液平衡。当不使用时，勿将 ni sepharose 6 fast flow 保存于含还原性试剂的缓冲液中。
6. 填料是否可以重复使用？可以使用多少次?
如果维护的好的话, 填料在其效期之内可以一直重复使用。如果每次都是纯化同样的蛋白就没有必要剥离掉镍离子重新挂镍，一般经过 5-7 次纯化之后可以进行脱镍和再生镍的操作。如果柱子反压高了，填料需要做*的在位清洗 cip，在清洗之前，为了避免金属盐的沉淀，需要剥离掉镍离子，然后再重新挂镍，清洗后保存在 20％ 的乙醇中。
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1. his 标签蛋白没有与柱结合：
a. 可能原因：超声的功率不对 ( 太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放)。
解决方法：改变超声功率，并在超声前加入*。
b. 可能原因：样品或者是结合缓冲液不正确。
解决方法：检测 ph 及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。
c. 可能原因：*标签暴露不*。
解决方法：在变性条件下 ( 用 4-8 m 脲，或 4-6 m 盐酸胍) 进行纯化。
d. 可能原因：his 标签丢失。
解决方法 1：wb 检查 his 是否表达，上游构建，改变 his-tag 的位置 (c- 端或 n- 端)，必要时增加 his 个数。
解决方法 2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。
解决方法 3：改变螯合的金属离子，寻找到*的结合金属离子。
ni2+ 通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数 6×his 标记的重组蛋白质的选金属离子。也是一般zui常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 ph，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 ni2+。
2. his 标签蛋白没有被洗脱下来：
a. 可能原因：洗脱条件太温和 （*标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）。
解决方法：增加咪唑的梯度洗脱或降低 ph 来找出*的洗脱条件。
b. 可能原因：降低 ph 的方法洗脱的，若 ph 低于 3.5，会导致镍离子脱落。
解决方法：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱。
c. 可能原因：蛋白已沉淀在柱上。
解决方法： 减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变 nacl 的浓度，或在变性条件 ( 去折叠) 下洗脱 ( 用 4～8 m 脲，或 4～6 m 盐酸胍)。
d. 可能原因：非特异性疏水或其他相互反应。
解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液 (如：2% triton x-100) 或增加 nacl 的浓度。
3. his 标签蛋白洗脱后杂带较多
a. 可能原因：蛋白酶部分降解了标签蛋白。
解决方法：添加蛋白酶抑制剂。
b. 可能原因：杂质对镍离子有更高的亲和性。
解决方法 1：咪唑浓度必须优化，以确保高纯度 ( 宿主细胞蛋白质的低结合) 和高产率 ( *标记的目标蛋白质的强结合) 之间的*平衡。分步或者线性洗脱摸索出*的咪唑结合和清洗浓度; 在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑; 咪唑的梯度不大 (20 个或更多的柱床体积)，可能分离出有相似结合强度的蛋白。
解决方法 2：筛选的缓冲液条件，nacl 浓度，ph 的范围都需要进行筛选。对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时，将缓冲液、盐、甘油和还原剂设计成不同的混合配方来进行优化。
解决方法 3：若以上优化的条件都不能去除杂质蛋白，需要考虑多步纯化的思路，如利用 strep 标签进行两步纯化或采用 subtractive method 进行纯化。
c. 可能原因：杂质和标签蛋白结合在一起。
解决方法：在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂; 增加去垢剂的浓度 ( 2% triton x-100 or 2% tween 20); 或者在 wash buffer 中增加甘油的浓度 (50%) 减少非特异性的相互反应; 考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子。
d. 可能原因：洗涤不充分。
解决方法：增加洗涤的次数，使洗涤充分。
4. 使用几次后 ni 柱载量下降，挂柱效率低，如何处理？
可能原因：逐渐积累沉淀，变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点，而通过洗脱液无法*清洗所致。
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因此，若您的样品中含有 dtt，在上样之前, 我们*采用不含还原性试剂的空白运行来除去任何较弱结合的镍离子；空白运行方法（使用不含还原剂的平衡液和洗脱液）1）5 倍柱体积的双蒸水洗柱 ；2）5 倍柱体积的平衡液洗柱；3）5 倍柱体积的洗脱液洗柱；4）10 倍柱体积的平衡液平衡。当不使用时，勿将 ni sepharose 6 fast flow 保存于含还原性试剂的缓冲液中。
6. 填料是否可以重复使用？可以使用多少次?
如果维护的好的话, 填料在其效期之内可以一直重复使用。如果每次都是纯化同样的蛋白就没有必要剥离掉镍离子重新挂镍，一般经过 5-7 次纯化之后可以进行脱镍和再生镍的操作。如果柱子反压高了，填料需要做*的在位清洗 cip，在清洗之前，为了避免金属盐的沉淀，需要剥离掉镍离子，然后再重新挂镍，清洗后保存在 20％ 的乙醇中。
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