inscopix nVoke研究发现猝倒的真凶！自由在体神经元成像系统
发作性睡病（narcolepsy）是一种由大脑神经系统障碍引起的疾病，其症状包括嗜睡、睡眠瘫痪、睡眠幻觉和猝倒。猝倒指在清醒状态下，患者全身肌肉突然松弛无力，进入数秒乃至数分钟的睡眠状态，伴随着*的安全隐患，尤为可怕。
近日，来自南卡罗莱纳医科大学的研究人员利用由格罗贝尔生物科技引进中国并始终代理的美国inscopix公司的nvoke™在体钙成像系统，*发现了位于杏仁核*区域（cea）的gabaergic神经元在小鼠猝倒过程中的异常兴奋现象，相关结果发表于elife杂志。
图1. 实验动物免疫组化与荧光显微图像
研究人员敲除了小鼠的促食素基因（图1b，促食素免疫染色），从而得到嗜睡症模型动物。该促食素缺失小鼠与slc32a1-ires-cre+/+小鼠杂交，在后代基因组中插入gcamp6s基因，得到了gabaergic神经元可以特异性表达钙指示荧光蛋白的嗜睡症模型小鼠（图1 c-g，绿色为钙荧光，图f为gabaergic神经元指示物vgat染色照片，与图e钙荧光重合度95%），作为实验组。促食素未敲除的转基因小鼠（图1a）作为对照组。
图2. 小鼠睡眠与清醒过程gabaergic神经元活动状态
研究人员对实验组和对照组各5只小鼠在睡眠和情绪阶段进行了钙成像和脑电肌电监测（图2a，b），钙成像在两个组别中各识别出了186个和207个gabaergic神经元细胞。研究发现，不同的gabaergic细胞会在睡眠的不同阶段被激活，使用δf/f来表征细胞荧光强度的变化幅度，计算各阶段细胞δf/f的z分数来剔除细胞数量干扰。图2b展示了4种典型的细胞，分别为在快速动眼睡眠rems阶段激活、在非快速动眼睡眠nrems阶段激活、在活跃清醒aw阶段激活和几乎不激活。在各睡眠和清醒阶段的细胞分布比例上，两组别没有显示出显著的区别。
图3. 嗜睡组小鼠各神经细胞在不同阶段z分数变化曲线
在不受干扰的睡眠与清醒状态结束后，小鼠被暴露于狼尿的气味刺激下，两组小鼠均表现出了典型的好奇与恐惧反应。对照组小鼠在该阶段的z分数有明显提高，但统计学上不显著（p=0.46，图2c）。然而在嗜睡病小鼠中，经过3分钟的气味暴露，z分数显著升高（p<0.001，图2c，图3）；呈现激活状态细胞的比例从31.88%提升到了60.22%，几乎翻了一倍。研究人员将这种受刺激后z值明显高于未受干扰时平均z值的aw定义为过度活跃清醒haw，将由这种haw引发的卒倒定义为情绪介导的卒倒ec。相反的，如果卒倒前只有普通的aw，这次卒倒则被定义为自发性卒倒sc。
在实验中，研究人员共在实验组小鼠中观测到了10次sc和14次ec，而对照组一次卒倒都没有发生，这说明促食素的存在可以明显有效抑制gabaergic神经元过度兴奋。在实验组被记录的186个神经元中，15个细胞被标识为sc激活，74个细胞为ec激活，两者之间相互独立没有重叠，而在这74个ec激活细胞中，50%来自先前未得分的细胞，23%来自aw激活细胞。因此，在不受干扰下的睡眠/清醒活动中沉默的神经元，反而与猝倒有着密不可分的关系（图3c，f）。
图4. 狼尿刺激前后神经元活动趋势图
由图4可见，在不受刺激的睡眠/清醒阶段，实验组小鼠有着明显低于对照组的神经元活动强度，然而在经过捕食者气味暴露后，实验组小鼠的神经元则开始大规模高强度活跃。这在反映了gabaergic神经元参与介导卒倒的同时，也说明促食素参与的调节通路*水平的调节杏仁核区域的神经元活动，使其能维持正常的活动水平。促食素的缺失使得杏仁核*区域的gabaergic神经元活动处于过于不同步（未受刺激）和超同步（受刺激）的两个态。这说明，针对神经元超同步现象的治疗可能会对发作性睡病起到较好的效果。
关于杏仁核中存在卒倒激活神经元的现象在2002年便有报道，而直到今年，科学家才利用高效的基因编辑和*的在体钙成像工具nvoke™，从以前不可能想象的方式，第yi次成功观察到了gabaergic神经元在卒倒过程的实时兴奋动态，甚至对每一个细胞的时间行为进行了追踪，为后续科学家进一步探索生理病理机制提供了敲门砖，让人不得不感叹科技进步的强大力量，好的工具真的能让人事半功倍！
不过，nvoke™可不止钙成像这么简单，看完这篇文章的你，是不是觉得gabaergic神经元过度兴奋与卒倒之间的因果关系并没有被作者证明？要不要来猜一猜这个实验还能如何进一步完善呢？欢迎留言！
特别声明：格罗贝尔生物科技公司（美国global bietech inc）是inscopix进入中国后于2017年*且始终*的中国代理商，拥有几十家国内yi流科研水平的实验室用户服务经验。始终如一高水平售后技术服务是您完成此项实验的根本保障，请在购买前与我们做更深入的技术咨询和交流！
参考文献：
[1] sun, y.,bendell, e., & liu, m. (2019). activity dynamics of amygdala gabaergicneurons during cataplexy of narcolepsy.elife,8.
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近日，来自南卡罗莱纳医科大学的研究人员利用由格罗贝尔生物科技引进中国并始终代理的美国inscopix公司的nvoke™在体钙成像系统，*发现了位于杏仁核*区域（cea）的gabaergic神经元在小鼠猝倒过程中的异常兴奋现象，相关结果发表于elife杂志。
图1. 实验动物免疫组化与荧光显微图像
研究人员敲除了小鼠的促食素基因（图1b，促食素免疫染色），从而得到嗜睡症模型动物。该促食素缺失小鼠与slc32a1-ires-cre+/+小鼠杂交，在后代基因组中插入gcamp6s基因，得到了gabaergic神经元可以特异性表达钙指示荧光蛋白的嗜睡症模型小鼠（图1 c-g，绿色为钙荧光，图f为gabaergic神经元指示物vgat染色照片，与图e钙荧光重合度95%），作为实验组。促食素未敲除的转基因小鼠（图1a）作为对照组。
图2. 小鼠睡眠与清醒过程gabaergic神经元活动状态
研究人员对实验组和对照组各5只小鼠在睡眠和情绪阶段进行了钙成像和脑电肌电监测（图2a，b），钙成像在两个组别中各识别出了186个和207个gabaergic神经元细胞。研究发现，不同的gabaergic细胞会在睡眠的不同阶段被激活，使用δf/f来表征细胞荧光强度的变化幅度，计算各阶段细胞δf/f的z分数来剔除细胞数量干扰。图2b展示了4种典型的细胞，分别为在快速动眼睡眠rems阶段激活、在非快速动眼睡眠nrems阶段激活、在活跃清醒aw阶段激活和几乎不激活。在各睡眠和清醒阶段的细胞分布比例上，两组别没有显示出显著的区别。
图3. 嗜睡组小鼠各神经细胞在不同阶段z分数变化曲线
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在实验中，研究人员共在实验组小鼠中观测到了10次sc和14次ec，而对照组一次卒倒都没有发生，这说明促食素的存在可以明显有效抑制gabaergic神经元过度兴奋。在实验组被记录的186个神经元中，15个细胞被标识为sc激活，74个细胞为ec激活，两者之间相互独立没有重叠，而在这74个ec激活细胞中，50%来自先前未得分的细胞，23%来自aw激活细胞。因此，在不受干扰下的睡眠/清醒活动中沉默的神经元，反而与猝倒有着密不可分的关系（图3c，f）。
图4. 狼尿刺激前后神经元活动趋势图
由图4可见，在不受刺激的睡眠/清醒阶段，实验组小鼠有着明显低于对照组的神经元活动强度，然而在经过捕食者气味暴露后，实验组小鼠的神经元则开始大规模高强度活跃。这在反映了gabaergic神经元参与介导卒倒的同时，也说明促食素参与的调节通路*水平的调节杏仁核区域的神经元活动，使其能维持正常的活动水平。促食素的缺失使得杏仁核*区域的gabaergic神经元活动处于过于不同步（未受刺激）和超同步（受刺激）的两个态。这说明，针对神经元超同步现象的治疗可能会对发作性睡病起到较好的效果。
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