聚合物纳米颗粒在活体小鼠颈动脉斑块负荷成像中的NIR-II应用
本文要点：大多数动脉粥样硬化血栓事件（例如，脑或心肌梗死）通常是由颈动脉斑块破裂或侵蚀引起的，因此迫切需要评估斑块的脆弱性并预测不良脑血管事件。然而，由于没有足够的空间分辨率来基于大多数报道的荧光探针对颈动脉进行成像，因此监测细长颈动脉中从稳定斑块到危及生命的高危斑块的演变是一个巨大的挑战。
研究内容：本文报道的nir-ii纳米探针是受体-供体-受体-供体-受体（a-d-a′-d-a）分子和给电子单元（d′）共聚，具有高量子产率和良好的稳定性，能够以足够的空间分辨率对细长的颈动脉血管进行成像。nir-ii纳米探针还可以有效靶向斑块内巨噬细胞，同时区分活体小鼠颈动脉粥样硬化中的易损斑块。nir-ii纳米探针可以动态监测颈动脉斑块中的新鲜出血点。此外，磁共振成像与nir-ii荧光成像相结合，通过将超小的超顺磁性氧化铁加入nir-ii纳米探针中，提高细微的结构的对比度。因此，这种混合nir-ii/磁共振成像多模式纳米探针为评估颈动脉斑块负荷、选择高危斑块和对斑块内出血进行成像提供了一种有效的工具，有望降低脑/心肌梗死相关的发病率和死亡率。（figure.1）
figure.1
figure.2
半导体聚合物的合成路线如fig.2a所示，通过a-d-a′-d-a分子与各种给体单元(即噻吩、苯并二噻吩和二硫苯并噻二唑)共聚，分别合成了3种半导体聚合物，即nir-1、nir-2和nir-3。fig.2c展示了nir-1的密度泛函理论分子轨道图，由于多重ict，homo-lumo发生分离，使吸收波长延长。作者还研究了这些半导体聚合物在甲苯中的吸收光谱与发射光谱（fig.2d、e），其中nir-1显示出吸收峰与荧光强度。
为了提高生物安全性和血液循环时间，采用纳米沉淀法（fig.2b），通过dspe-peg2000将半导体聚合物转化为半导体聚合物纳米颗粒(spns)。透射电子显微镜(tem)证实spns(nir-1)大致呈球形(fig.2h),动态光散射尺寸为43-50nm。如fig.2 f、g所示，spns(nir-1)、spns(nir-2)和spns(nir-3)的吸收峰分别为780、830和800 nm，并且均表现出较强的荧光发射，其中spns(nir-1)的荧光中心峰。为了研究spns的nir-ii荧光性能，使用icg作为参考，在808 nm激发下，spns(nir-1)表现出荧光强度（fig.2 i、j）。此外，spns(nir-1)的荧光强度随着浓度升高而升高（fig.2k）。在激光连续照射后，这些spns的荧光略有衰减，icg荧光衰减（fig.2l）。考虑到spns(nir-1)拥有荧光信号和荧光稳定性，后期实验选择了spns(nir-1)。
nir-ii /mri混合纳米粒子的构建。首先，在有机溶剂中采用热解的方法合成了spio纳米粒子，然后采用一步式纳米沉淀法制备了混合半导体聚合物纳米颗粒@超顺磁性氧化铁(spns(nir-1)@ spio)（fig.2b）。使用核磁共振分析仪测量溶液中spns(nir-1)@ spio的纵向(r1)和横向(r2)弛豫，r2/r1比为38.8（fig.2n）。spns(nir-1)@ spio的mr图像显示，t2加权mri信号强度随着浓度的增加逐渐降低（fig.2o），而nir-ii图像显示，nir-ii荧光信号随着浓度的增加而增加（fig.2p）。这些结果表明了spns(nir-1)@ spio在双模态mr和nir-ii荧光成像中的潜力。
figure.3
接下来作者进行了体内实验，制备了左侧颈动脉粥样硬化斑块小鼠模型（as小鼠）（fig.3a），he染色图像（fig.3b）显示，小鼠的左侧颈动脉（lca）中动脉粥样硬化斑块局部形成，而右侧颈动脉(rca)保持通畅且无斑块。注射spns(nir-1)后进行nir-ii荧光成像，lca的荧光强度高于rca的荧光强度（fig.3c），沿其中的红线rca和lca中的荧光强度分布如fig.3d所示。为了探索颈动脉粥样硬化斑块的mri成像，对as小鼠静脉注射spns(nir-1)@spio，fig.3e、f是2个随机的非连续切片，比较注射前(绿色圆圈)和注射后(橙色圆圈)图像，发现注射后斑块中的脂质池(白色箭头)变得略暗。考虑到巨噬细胞是易损斑块的靶点，作者探索了巨噬细胞对spns(nir-1)的细胞摄取。使用cy5.5标记nir-1制备成得到cy5.5-spns（nir-1），与巨噬细胞raw264.7共孵育，发现随着时间延长，细胞的荧光强度逐渐增强（fig.3h、i）。此外，还对比了血管内皮细胞（c166），结果表明cy5.5-spns（nir-1）可以被巨噬细胞而不是上皮细胞有效地摄取（fig.3j、k）。
figure.4
作者还进行了nir-ii成像鉴别体内不稳定斑块的实验。使用健康小鼠作为对照，分别对动脉粥样硬化小鼠(as小鼠)和动脉粥样硬化合并急性间质性肺炎小鼠(as小鼠+aip)的颈动脉斑块进行了nir-ii荧光成像(fig.4a)。分析病理特征(fig.4b)，健康小鼠的无斑块血管、as小鼠的动脉粥样硬化血管变窄和斑块(绿色虚线)以及as小鼠+ aip的斑块(绿色虚线)中有一个大的软脂质池(黑色虚线)。肺部he染色图像(fig.4b)、体温变化曲线(fig.4c)、中性粒细胞和外周血白细胞（wbcs）计数图(fig.4d)均表明lps处理的小鼠的具有肺部炎症。
为了测试spns(nir-1)对颈动脉不稳定斑块进行nir-ii荧光成像的能力，向健康小鼠、as小鼠和as+aip小鼠静脉注射spns(nir-1)，由nir-ii荧光图像可知，随着时间增加，as小鼠和as+aip小鼠的lca荧光信号逐渐增强(fig.4e)，从定量结果来看，在注射后120分钟，as小鼠+ aip小鼠的lca荧光信号分别是as小鼠或健康小鼠的3倍或15倍(fig.4g)。
作者还研究了这些小鼠的血脂水平和炎症指标，与健康小鼠相比，as小鼠和as小鼠+aip表现出tg和总胆固醇（tc）水平增加，as小鼠+aip显示出比as小鼠或健康小鼠更低的hdl-c水平，表明胆固醇去除能力降低，这可能导致动脉粥样硬化病变(fig.4i)。通过免疫荧光染色检测了巨噬细胞在颈动脉中的浸润，发现as小鼠和as小鼠+aip中浸润的巨噬细胞更多(fig.4j、k)。
figure.5
斑块内出血（iph）（尤其是颈动脉），被认为是高危斑块的重要信号，可能导致缺血性中风和血栓性并发症。为了制备iph模型，向lca中的动脉粥样硬化斑块微注射小剂量或大剂量的新鲜血液，同时以as小鼠作为对照组(fig.5a)。左颈动脉的代表性he染色图像证实了新鲜血液局部注入后斑块内iph的存在（fig.5b）。fig.5c展示了在iph后1小时向小鼠静脉注射spns(nir-1)的荧光图像，fig.5e、f显示了不同组在不同时间点的lca和rca的荧光强度。从离体图像来看，as小鼠+大iph的lca荧光强度分别是as小鼠+小iph和as小鼠的1.7倍和4.17倍(fig.5d、g)。这些结果证明了spns(nir-1)在小鼠中进行iph nir-ii成像的巨大潜力，并且有利于对易损斑块进行早期成像并给出预警信号。
总结：作者筛选了一系列具有强吸收/发射的nir-ii荧光聚合物，选择了一种具有良好的nir-ii荧光qy的荧光聚合物，并将其制备成纳米探针。spns(nir-1)显示了颈动脉血管造影术的nir-ii荧光成像在空间分辨率方面的优势。此外，作者采用spns(nir-1)通过颈动脉中荧光信号的动态变化来区分易损斑块与稳定斑块以及iph。动脉内荧光强度的局部变化与斑块的病理特征有很好的相关性。此外，作者通过在nir-ii纳米探针中加入超小spio效应制备了混合nir-ii/mri多模式探针，为颈动脉斑块的空间成像提供了有效工具。因此，这种新型的血管成像平台可用于早期监测斑块的病理变化，为监测和早期预警颈动脉高危斑块提供了有力的成像工具。
参考文献
xu, l.; li, z.; ma, y.; lei, l.; yue, r.; cao, h.; huan, s.; sun, w.; song, g., imaging carotid plaque burden in living mice via hybrid semiconducting polymer nanoparticles-based near-infrared-ii fluorescence and magnetic resonance imaging. research 2023, 6.
⭐️ ⭐️ ⭐️
近红外二区小动物活体荧光成像系统 - mars
nir-ii in vivo imaging system
高灵敏度 -采用princeton instruments深制冷相机，活体穿透深度高于15mm
高分辨率 -定制高分辨大光圈红外镜头，空间分辨率优于3um
荧光寿命 -分辨率优于5us
高速采集 -速度优于1000fps（帧每秒）
多模态系统 -可扩展x射线辐照、荧光寿命、一区荧光成像、原位成像光谱，ct等
显微镜 -近红外二区高分辨显微系统，兼容成像型光谱仪
⭐️ ⭐️ ⭐️
恒光智影
上海恒光智影医疗科技有限公司，被评为上海市“科技创新行动计划”科学仪器领域立项单位。
恒光智影，致力于为生物医学、临床前和临床应用等相关领域的研究提供*的、一体化的成像解决方案。
与基于可见光/近红外一区的传统荧光成像技术相比，我们的技术侧重于近红外二区范围并整合ct, x-ray，超声，光声成像技术。
可为肿瘤药理、神经药理、心血管药理、大分子药代动力学等一系列学科的科研人员提供清晰的成像效果，为用户提供前沿的生物医药与科学仪器服务。
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figure.1
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figure.3
接下来作者进行了体内实验，制备了左侧颈动脉粥样硬化斑块小鼠模型（as小鼠）（fig.3a），he染色图像（fig.3b）显示，小鼠的左侧颈动脉（lca）中动脉粥样硬化斑块局部形成，而右侧颈动脉(rca)保持通畅且无斑块。注射spns(nir-1)后进行nir-ii荧光成像，lca的荧光强度高于rca的荧光强度（fig.3c），沿其中的红线rca和lca中的荧光强度分布如fig.3d所示。为了探索颈动脉粥样硬化斑块的mri成像，对as小鼠静脉注射spns(nir-1)@spio，fig.3e、f是2个随机的非连续切片，比较注射前(绿色圆圈)和注射后(橙色圆圈)图像，发现注射后斑块中的脂质池(白色箭头)变得略暗。考虑到巨噬细胞是易损斑块的靶点，作者探索了巨噬细胞对spns(nir-1)的细胞摄取。使用cy5.5标记nir-1制备成得到cy5.5-spns（nir-1），与巨噬细胞raw264.7共孵育，发现随着时间延长，细胞的荧光强度逐渐增强（fig.3h、i）。此外，还对比了血管内皮细胞（c166），结果表明cy5.5-spns（nir-1）可以被巨噬细胞而不是上皮细胞有效地摄取（fig.3j、k）。
figure.4
作者还进行了nir-ii成像鉴别体内不稳定斑块的实验。使用健康小鼠作为对照，分别对动脉粥样硬化小鼠(as小鼠)和动脉粥样硬化合并急性间质性肺炎小鼠(as小鼠+aip)的颈动脉斑块进行了nir-ii荧光成像(fig.4a)。分析病理特征(fig.4b)，健康小鼠的无斑块血管、as小鼠的动脉粥样硬化血管变窄和斑块(绿色虚线)以及as小鼠+ aip的斑块(绿色虚线)中有一个大的软脂质池(黑色虚线)。肺部he染色图像(fig.4b)、体温变化曲线(fig.4c)、中性粒细胞和外周血白细胞（wbcs）计数图(fig.4d)均表明lps处理的小鼠的具有肺部炎症。
为了测试spns(nir-1)对颈动脉不稳定斑块进行nir-ii荧光成像的能力，向健康小鼠、as小鼠和as+aip小鼠静脉注射spns(nir-1)，由nir-ii荧光图像可知，随着时间增加，as小鼠和as+aip小鼠的lca荧光信号逐渐增强(fig.4e)，从定量结果来看，在注射后120分钟，as小鼠+ aip小鼠的lca荧光信号分别是as小鼠或健康小鼠的3倍或15倍(fig.4g)。
作者还研究了这些小鼠的血脂水平和炎症指标，与健康小鼠相比，as小鼠和as小鼠+aip表现出tg和总胆固醇（tc）水平增加，as小鼠+aip显示出比as小鼠或健康小鼠更低的hdl-c水平，表明胆固醇去除能力降低，这可能导致动脉粥样硬化病变(fig.4i)。通过免疫荧光染色检测了巨噬细胞在颈动脉中的浸润，发现as小鼠和as小鼠+aip中浸润的巨噬细胞更多(fig.4j、k)。
figure.5
斑块内出血（iph）（尤其是颈动脉），被认为是高危斑块的重要信号，可能导致缺血性中风和血栓性并发症。为了制备iph模型，向lca中的动脉粥样硬化斑块微注射小剂量或大剂量的新鲜血液，同时以as小鼠作为对照组(fig.5a)。左颈动脉的代表性he染色图像证实了新鲜血液局部注入后斑块内iph的存在（fig.5b）。fig.5c展示了在iph后1小时向小鼠静脉注射spns(nir-1)的荧光图像，fig.5e、f显示了不同组在不同时间点的lca和rca的荧光强度。从离体图像来看，as小鼠+大iph的lca荧光强度分别是as小鼠+小iph和as小鼠的1.7倍和4.17倍(fig.5d、g)。这些结果证明了spns(nir-1)在小鼠中进行iph nir-ii成像的巨大潜力，并且有利于对易损斑块进行早期成像并给出预警信号。
总结：作者筛选了一系列具有强吸收/发射的nir-ii荧光聚合物，选择了一种具有良好的nir-ii荧光qy的荧光聚合物，并将其制备成纳米探针。spns(nir-1)显示了颈动脉血管造影术的nir-ii荧光成像在空间分辨率方面的优势。此外，作者采用spns(nir-1)通过颈动脉中荧光信号的动态变化来区分易损斑块与稳定斑块以及iph。动脉内荧光强度的局部变化与斑块的病理特征有很好的相关性。此外，作者通过在nir-ii纳米探针中加入超小spio效应制备了混合nir-ii/mri多模式探针，为颈动脉斑块的空间成像提供了有效工具。因此，这种新型的血管成像平台可用于早期监测斑块的病理变化，为监测和早期预警颈动脉高危斑块提供了有力的成像工具。
参考文献
xu, l.; li, z.; ma, y.; lei, l.; yue, r.; cao, h.; huan, s.; sun, w.; song, g., imaging carotid plaque burden in living mice via hybrid semiconducting polymer nanoparticles-based near-infrared-ii fluorescence and magnetic resonance imaging. research 2023, 6.
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