GB 5009.111-2016食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定
中华人民共和国国家标准
gb 5009.111-2016
食品安全国家标准
食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定
前言
本标准代替gb/t 5009.111-2003《谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》、gb/t 23503-2009《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、sn/t 1571-2005《进出口粮谷中呕吐毒素检验方法液相色谱法》。
本标准与gb/t 5009.111-2003相比，主要变化如下：
——标准名称修改为“食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定”；
——增加了方法的适用范围；
——增加了食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇乙酰化衍生物的测定；
——增加了同位素稀释液相色谱-串联质谱法；
——增加了固相萃取柱净化的前处理方式；
——增加了免疫亲和柱净化-高效液相色谱法；
——增加了商业化免疫亲和柱评价技术参数要求。
1范围
本标准规定了食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定方法。
第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法，适用于谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。
第二法为免疫亲和层析净化高效液相色谱法，适用于谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。
第三法为薄层色谱测定法，第四法为酶联免疫吸附筛查法，适用于谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。
第一法同位素稀释液相色谱-串联质谱法
2原理
试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇用水和乙腈的混合溶液提取，提取上清液经固相萃取柱或免疫亲和柱净化，浓缩、定容和过滤后，超高压液相色谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1乙腈(ch3cn)：色谱纯。
3.1.2甲醇(ch3oh)：色谱纯。
3.1.3正己烷(c6h14)。
3.1.4氨水(nh3·h2o)。
3.1.5甲酸(hcooh)。
3.1.6氮气(n2)：纯度≥99.9%。
3.2试剂配制
3.2.1乙腈-水溶液(84+16)：量取160ml水加入到840ml乙腈中，混匀。
3.2.2乙腈饱和的正己烷溶液：量取200ml正己烷于250ml分液漏斗中，加入少量乙腈，剧烈振摇数分钟，静置分层，弃去下层乙腈层即得。
3.2.3甲醇-水溶液(5+95)：量取5ml甲醇加入到95ml水中，混匀。
3.2.4 0.01%氨水溶液：取100μl氨水加入到1000ml水中，混匀(仅供离子源模式为esi-时使用)。
3.2.5 0.1%甲酸溶液：取1ml甲酸加入到1000ml水中，混匀(仅供离子源模式为esi+时使用)。
3.3标准品
3.3.1脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don，c15h20o6，cas号：51481-10-8)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2 3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-adon，c17h22o7，cas号：50722-38-8)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.3 15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-adon，c17h22o7，cas号：88337-96-6)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.413c15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇同位素标准溶液(13c-don，13c15h20o6)：25μg/ml，纯度≥99%。
3.3.513c17-3-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇同位素标准溶液(13c-3-adon，13c17h22o7)：25μg/ml，纯度≥99%。
3.4标准溶液配制
3.4.1标准储备溶液(100μg/ml)：分别称取don、3-adon和15-adon 1mg(准确至0.01mg)，分别用乙腈溶解并定容至10ml。将溶液转移至试剂瓶中，在-20℃下密封保存，有效期1年。
3.4.2混合标准工作溶液(10μg/ml)：准确吸取100μg/mldon、3-adon和15-adon标准储备液各1.0ml于同一10ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在-20℃下密封保存，有效期半年。
3.4.3混合同位素内标工作液(1μg/ml)：准确吸取13c15-don和13c17-3-adon同位素内标
(25μg/ml)各1ml于同一25ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在- 20℃下密封保存，有效期半年。
3.4.4标准系列工作溶液：准确移取适量混合标准工作溶液和混合同位素内标工作液，用初始流动相配制成10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml、320ng/ml、640ng/ml的混合标准系列，其中同位素内标浓度为100ng/ml。标准系列溶液于4℃保存，有效期7d。
4仪器和设备
4.1液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源。
4.2电子天平：感量0.01g和0.00001g。
4.3高速粉碎机：转速10000r/min。
4.4匀浆机。
4.5筛网：0.5mm~1mm孔径。
4.6超声波/涡旋振荡器或摇床。
4.7氮吹仪。
4.8高速离心机：转速不低于12000r/min。
4.9移液器：量程10μl~100μl和100μl~1000μl。
4.10固相萃取装置。
4.11通用型固相萃取柱：兼具亲水基团(吡咯烷酮基团)和疏水基团(二乙烯基苯)吸附剂填料的固相萃取小柱，200mg，6ml，或相当者。
4.12dons专用型固相净化柱，或相当者。
4.13脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱：柱容量≥1000ng(柱容量和柱回收率验证方法参见a.2)。
4.14水相微孔滤膜：0.22μm。
5分析步骤
5.1试样制备
5.1.1谷物及其制品：取至少1kg样品，用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于0.5mm~1mm孔径试验筛，混合均匀后缩分至100g，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。
5.1.2酒类：取散装酒至少1l，对于袋装、瓶装等包装样品至少取3个包装(同一批次或号)，将所有液体试样在一个容器中用均质机混匀后，缩分至100g(ml)储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。含二氧化碳的酒类样品使用前应先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气后方可使用。
5.1.3酱油、醋、酱及酱制品：取至少1l样品，对于袋装、瓶装等包装样品至少取3个包装(同一批次或号)，将所有液体样品在一个容器中用匀浆机混匀后，缩分至100g(ml)储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。
5.2试样提取
5.2.1谷物及其制品：称取2g(准确至0.01g)试样于50ml离心管中，加入400μl混合同位素内标工作液振荡混合后静置30min。加入20.0ml乙腈-水溶液(84+16)，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min。10000r/min离心5min，收集上清液a于干净的容器中备用。
5.2.2酒类：称取5g(准确至0.01g)试样于50ml离心管中，加入200μl混合同位素内标工作液振荡混合后静置30 min，用乙腈定容至10 ml，混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min。10000r/min离心5min，收集上清液b于干净的容器中备用。
5.2.3酱油、醋、酱及酱制品：称取2g(准确至0.01g)试样于50ml离心管中，加入400μl混合同位素内标工作液振荡混合后静置30min。加入20.0ml乙腈-水溶液(84+16)，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min。10000r/min离心5min，收集上清液c于干净的容器中备用。
5.3试样净化
注：下述试样的净化方法，可根据实际情况，选择其中一种方法即可。
5.3.1通用型固相萃取柱净化
取5ml上清液a或上清液b或上清液c置于50ml离心管中，加入10ml乙腈饱和正己烷溶液，涡旋混合2min，5000r/min离心2min，弃去正己烷层后，于40℃~50℃下氮气吹干，加入4ml水充分溶解残渣，待净化。
将固相萃取柱连接到固相萃取装置，先后用3ml甲醇和3ml水活化平衡。将4ml上述水复溶液上柱，控制流速为每秒1滴~2滴。用3ml水、1ml5%甲醇-水溶液依次淋洗柱子后彻（che）底抽干。用4ml甲醇洗脱，收集全部洗脱液后在40℃~50℃下氮气吹干。加入1.0ml初始流动相溶解残留物，涡旋混匀10s，用0.22μm微孔滤膜过滤于进样瓶中，待进样。
5.3.2 dons专用型固相净化柱净化
取8ml上清液a或上清液b或上清液c至dons专用型固相净化柱的玻璃管内，将净化柱的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管至净化液析出，移取5ml净化液于40℃~50℃下氮气吹干。加入1.0ml初始流动相溶解残留物，涡旋混匀10s，用0.22μm微孔滤膜过滤于进样瓶中，待进样。
5.3.3免疫亲和柱净化
事先将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。
准确移取5ml上清液a或上清液b或上清液c，于40℃~50℃下氮气吹干，加入2ml水充分溶解残渣，待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液移至玻璃注射器筒中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节下滴速度，控制样液以每秒1滴的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。用5ml pbs缓冲盐溶液和5ml水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为每秒1滴~2滴，直至空气进入亲和注中，弃去全部流出液，抽干小柱。
准确加入2ml甲醇洗脱亲和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脱液至试管中，在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0ml初始流动相，涡旋30s溶解残留物，0.22μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。
注：使用不同厂商的免疫亲和柱，在样品上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同，应该按照说明书要求进行操作。
5.4液相色谱-串联质谱参考条件(可根据实际情况参考其中一种方法即可)
5.4.1离子源模式：esi+液相色谱-质谱参考条件列出如下：
a)液相色谱柱：c18柱(柱长100mm，柱内径2.1mm；填料粒径1.7μm)，或相当者；
b)流动相：a相：0.1%甲酸溶液；b相：0.1%甲酸-乙腈；
c)梯度洗脱：2% b (0 min~0.8 min)，24% b (3.0 min~4.0 min)，100% b (6.0 min~
6.9min)，2% b(6.9min~7.0min)；
d)流速：0.35ml/min；
e)柱温：40℃；
f)进样体积：10μl；
g)毛细管电压：3.5kv；锥孔电压：30v；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：900l/h；
h)脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物质谱条件参考表1。
5.4.2离子源模式：esi-液相色谱-质谱参考条件列出如下：
a)液相色谱柱：c18柱(柱长100mm，柱内径2.1mm；填料粒径1.7μm)，或相当者；
b)流动相：a相：0.01%氨水溶液；b相：乙腈；
c)梯度洗脱：2% b(0min~0.8min)，24% b(3.0min~4.0min)，100% b(6.0min~6.9min)，
2% b(6.9min~7.0min)；
d)流速：0.35ml/min；
e)柱温：40℃；
f)进样体积：10μl；
g)毛细管电压：2.5kv；锥孔电压：45v；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：900l/h；
h)脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物质谱条件参考表2。
各化合物的离子扫描图、多反应监测(mrm)离子通道图参见图b.1~图b.8。
5.5定性测定
试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5%之内。
每种化合物的质谱定性离子应出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表3规定的范围。
5.6标准曲线的制作
在5.4液相色谱串联质谱仪分析条件下，将标准系列溶液由低到高浓度进样检测，以don、3-adon和15-adon色谱峰与各对应内标色谱峰的峰面积比值-浓度作图，得到标准曲线回归方程，其线性相关系数应大于0.99。
5.7试样溶液的测定
取5.2、5.3处理得到的待测溶液进样，内标法计算待测液中目标物质的质量浓度，按6计算样品中待测物的含量。试液中待测物的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应适当减少取样量后重新测定。
5.8空白试验
除不加试样外，按5.3和5.4的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。
6分析结果的表述
试样中don、3-adon或15-adon的含量按式(1)计算：
式中：
x——试样中don、3-adon或15-adon的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
ρ——试样中don、3-adon或15-adon按照内标法在标准曲线中对应的质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
v1——试样提取液体积，单位为毫升(ml)；
v3——试样最终定容体积，单位为毫升(ml)；
1000——换算系数；
v2——用于净化的分取体积，单位为毫升(ml)；
m——试样的称样量，单位为克(g)。
计算结果保留三位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的23%。
8其他
当称取谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品试样2g时，方法中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇检出限为10μg/kg，定量限为20μg/kg。
当称取酒类试样5g时，方法中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇检出限为5μg/kg，定量限为10μg/kg。
第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法
9原理
试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇用水提取，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱-紫外检测器测定，外标法定量。
10试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t6682规定的一级水。
10.1试剂
10.1.1甲醇(ch3oh)：色谱纯。
10.1.2乙腈(ch3cn)：色谱纯。
10.1.3聚乙二醇[相对分子质量为8000，ho(ch2ch2o)nh]。
10.1.4氯化钠(nacl)。
10.1.5磷酸氢二钠(na2hpo4)。
10.1.6磷酸二氢钾(kh2po4)。
10.1.7氯（lv）化钾(kcl)。
10.1.8盐酸(hcl)。
10.2试剂配制
10.2.1磷酸盐缓冲溶液(以下简称pbs)：称取8.00g氯化钠、1.20g磷酸氢二钠、0.20g磷酸二氢钾、0.20g氯（lv）化钾，用900ml水溶解，用盐酸调节ph至7.0，用水定容至1000ml。
10.2.2甲醇-水溶液(20+80)：量取200ml甲醇加入到800ml水中，混匀。
10.2.3乙腈-水溶液(10+90)：量取100ml乙腈加入到900ml水中，混匀。
10.3标准品
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(c15h20o6，cas号：51481-10-8)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4标准溶液配制
10.4.1标准储备溶液(100μg/ml)：称取脱氧雪腐镰刀菌烯醇1mg(准确至0.01mg)，用乙腈溶解并定容至10ml。将溶液转移至试剂瓶中，在-20℃下密封保存，有效期1年。
10.4.2标准系列工作溶液：准确移取适量脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准储备溶液用初始流动相稀释，配制成100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、5000ng/ml的标准系列工作液，4℃保存，有效期7d。
11仪器和设备
11.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。
11.2电子天平：感量0.01g和0.00001g。
11.3高速粉碎机：转速10000r/min。
11.4筛网：1mm~2mm孔径。
11.5超声波/涡旋振荡器或摇床。
11.6氮吹仪。
11.7高速离心机：转速≥12000r/min。
11.8移液器：量程10μl~100μl和100μl~1000μl。
11.9脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱：柱容量≥1000ng(柱容量和柱回收率验证方法参见a.2)。
注：对于不同批次的亲和柱在使用前需质量验证。
11.10玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5μm。
11.11水相微孔滤膜：0.45μm。
11.12聚丙烯刻度离心管：具塞，50ml。
11.13玻璃注射器：10ml。
11.14空气压力泵。
12分析步骤
使用不同厂商的免疫亲和柱，在试样上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同，应该按照说明书要求进行操作。
12.1试样制备
同5.1。
12.2试样提取
12.2.1谷物及其制品：称取25g(准确到0.1g)磨碎的试样于100ml具塞三角瓶中加入5g聚乙二醇，加水100ml，混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min。以玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清(或6000r/min下离心10min)，收集滤液a于干净的容器中。10000r/min离心5min。
12.2.2酒类：取酒样20g(准确到0.1g)，加入1g聚乙二醇，用水定容至25.0ml，混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min。用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清(或6000r/min下离心10min)，收集滤液b于干净的容器中。
12.2.3酱油、醋、酱及酱制品：称取样品25g(准确到0.1g)，加入5g聚乙二醇，用水定容至100ml，混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20 min。以玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清(或6000r/min下离心10min)，收集滤液c于干净的容器中。
12.3净化
事先将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液移至玻璃注射器筒中，准确移取上述滤液a或滤液b或滤液c2.0ml，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节下滴速度，控制样液以每秒1滴的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。用5mlpbs缓冲盐溶液和5ml水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为每秒1滴~2滴，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。
12.4洗脱
准确加入2ml甲醇洗脱亲和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脱液至试管中，在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0ml初始流动相，涡旋30s溶解残留物，0.45μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。
12.5液相色谱参考条件
液相色谱参考条件列出如下：
a)液相色谱柱：c18柱(柱长150mm，柱内径4.6mm；填料粒径5μm)，或相当者；
b)流动相：甲醇+水(20+80)；
c)流速；0.8ml/min；
d)柱温：35℃；
e)进样量：50μl；
f)检测波长：218nm。
12.6定量测定
12.6.1标准曲线的制作
以脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准工作液浓度为横坐标，以峰面积积分值纵坐标，将系列标准溶液由低到高浓度依次进样检测，得到标准曲线回归方程。
12.6.2试样溶液的测定
试样液中待测物的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应适当减少称样量，重新按12.2、12.3和12.4进行处理后再进样分析。
12.7空白试验
除不称取试样外，按12.2、12.3和12.4做空白试验。确认不含有干扰待测组分的物质。
13分析结果的表述
试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量按式(2)计算：
式中：
x——试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
ρ1——试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的质量浓度，单位纳克每毫升(ng/ml)；
ρ0——空白试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的质量浓度，单位纳克每毫升(ng/ml)；
v——样品洗脱液的最终定容体积，单位毫升(ml)；
f——样液稀释因子；
1000——换算系数；
m——试样的称样量，单位克(g)。
计算结果保留三位有效数字。
14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的23%。
15其他
当称取谷物及其制品、酱油、醋、酱及酱制品试样25g时，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检出限为100μg/kg，定量限为200μg/kg；当称取酒类试样20g时，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检出限为50μg/kg，定量限为100μg/kg。
第三法薄层色谱测定法
16原理
试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇经提取、净化、浓缩和硅胶g薄层展开后，加热薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板时加入了三氯化铝，使脱氧雪腐镰刀菌烯醇在365nm紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较。
17试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。
17.1试剂
17.1.1三氯（lv）甲烷(chcl3)。
17.1.2无水乙醇(ch3ch2oh)。
17.1.3甲醇(ch3oh)。
17.1.4石油醚(cnh2n+2)。
17.1.5乙酸乙酯(ch3cooch2ch3)。
17.1.6乙腈(ch3cn)。
17.1.7丙酮(ch3coch3)。
17.1.8异丙醇(ch3ch2ohch3)。
17.1.9乙（yi）醚(ch3ch2och2ch3)。
17.1.10氯化铝(alcl3·6h2o)：化学纯。
17.1.11中性氧化铝：经300℃活化4h，置干燥器中备用。
17.1.12活性炭：20g活性炭，用3mol/l盐酸溶液浸泡过夜，抽滤后，用热蒸馏水洗至无氯离子，在120℃烘干备用。
17.1.13硅胶g：薄层层析用。
17.2标准品
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(c15h20o6，cas号：51481-10-8)：纯度≥99%。
17.3标准溶液配制
标准储备溶液(25μg/ml)：称取脱氧雪腐镰刀菌烯醇5.0mg(准确到0.1mg)，加乙酸乙酯-甲醇(19+1)溶解，转入10ml容量瓶中，并定容至10ml。吸取此溶液0.5ml，用乙酸乙酯-甲醇(19+1)稀释至10ml。
18仪器和设备
18.1小型粉碎机。
18.2电动振荡器。
18.3玻璃蒸发皿：75ml。
18.4层析柱：内径2cm，长10cm，不具活塞。
18.5具塞浓缩瓶：10ml，底部具0.2ml刻度尾管。
18.6玻璃板：5cm×20cm。
18.7薄层涂布器：0.3mm。
18.8展开槽：内长26cm，宽6cm，高4cm。
18.9紫外光灯：365nm。
18.10微量注射器：10μl，50μl。
18.11平底管：50ml。
18.12双波长薄层扫描仪：带数据处理机。
19分析步骤
19.1试样提取
称取20g粉碎试样置于200ml具塞锥瓶中，加8ml和100ml三氯（lv）甲烷-无水乙醇(8+2)，密
塞。在瓶塞上涂层水，盖严防漏，振荡1h，通过折叠快速定性滤纸过滤，取25ml滤液于75ml玻璃蒸发皿中，置90℃水浴上通风挥干。
19.2净化
19.2.1液-液分配
19.2.1.1谷物：用50ml石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入100ml分液漏斗中，再用20ml(玉米试样用30ml)甲醇-水(4+1)分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中。
19.2.1.2谷物制品(蛋糕、饼干、面包等)：用100ml石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入250ml分液漏斗中，再用30ml甲醇-水(4+1)分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中。振荡分液漏斗1.5min，静置约15min使分层后，将下层甲醇-水提取液过柱净化，不要将两相交界处的白色絮状物放入柱内。
19.2.2柱净化
19.2.2.1小麦及其制品：在层析柱下端与小管连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加0.4g活性炭，敲紧。将层析柱下端小管插入一橡皮塞，塞在抽滤瓶上，抽滤瓶中放一平底管接受过柱液，将抽滤瓶接上水泵或真空泵，稍稍开启泵，使活性炭压紧，将分液漏斗中的甲醇-水提取液小心地沿管壁加入柱内，控制流速为每15秒18滴~20滴(3ml/min)，甲醇-水提取液过柱快完毕时，加入10ml甲醇-水(4+1)淋洗柱，抽滤，直至柱内不再有液体流出。过柱速度控制在2ml/min~3ml/min，速度太快净化效果不好，太慢耗时太长。
19.2.2.2玉米：同20.2.2.1，只是将活性炭的用量改为0.3g。
19.3制备薄层层析用样液
将过柱后的洗脱液倒入75ml玻璃蒸发皿中，用少量甲醇-水(4+1)洗涤平底管。将蒸发皿置沸水浴上浓缩至干：
a)小麦：趁热加入3ml乙酸乙酯，加热至沸，在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次，使充分沸腾将残渣中的don溶出，并将乙酸乙酯挥发至干，再加入3ml乙酸乙酯同样处理一次，将溶剂挥干，最后加3ml乙酸乙酯，加热至沸，放冷至室温后转入浓缩瓶中，再用3份1.5ml乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。
b)小麦制品和玉米：趁热加入3ml乙酸乙酯，加热至沸，在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次，使充分沸腾，将残渣中don溶出，放冷至室温后转入浓缩瓶中。加约0.5ml甲醇-丙酮(1+2)于蒸发皿中，用玻璃搅动溶解残渣，将蒸发皿置水浴锅上挥干溶剂后，加入3ml乙酸乙酯，加热至沸，转动蒸发皿，使充分沸腾，放冷至室温后转入同一浓缩瓶中，再用0.5ml甲醇-丙酮(1+2)和3ml乙酸乙酯同样处理一次，乙酸乙酯提取液并入浓缩瓶中。
将浓缩瓶置约95℃水浴锅上，用蒸汽加热吹氮气浓缩至干，放冷至室温后加入0.2ml三氯（lv）甲烷-乙腈(4+1)溶解残渣留作薄层层析用。
19.4测定
19.4.1薄层板的制备：4g硅胶g加约9ml15%氯化铝(alcl3·6h2o)水溶液，研磨约2min至呈黏稠状，铺成5cm×20cm的薄层板三块，置室温干燥后，于105℃活化1h，贮干燥器中备用。
19.4.2点样：在每块薄层板上距下端2.5cm的基线上点样。
第一块板：对每一个试样先点第一块薄层板，在距板左边缘1.8cm处点25μl试样液，在距板上端1.5cm处的横线上并与基线试样点相对应的位置上点2μldon标准液(50ng)。
第二块板：在第一块板上未显荧光的试样则需在第二块薄层板上距左边缘0.8cm~1cm处滴加样液点(根据情况估计滴加量，或稀释后定量)，在距板左边缘2cm处和在距右边缘1.2cm处分别滴加两个标准点，don的量可为50ng、75ng、100ng。再在距板上端1.5cm处的横线上点三个don标准点(各50ng)，使之与基线上的三个点相对应。
19.4.3展开：
横展剂：乙（yi）醚、乙（yi）醚-丙酮(95+5)或无水乙（yi）醚。任选其中一种，使试样don点偏离原点0.7cm~1cm，刚好与杂质荧光分开。
纵展剂：三氯（lv）甲烷-丙酮-异丙醇(8+1+1)；
三氯（lv）甲烷-丙酮-异丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1)。
19.4.3.1横展：在展开槽内倒入10ml横展剂。将点好样的薄层板靠样液点的长边斜浸入溶剂，展至板端1min~2min，取出通风挥干3min。对小麦制品还须再用10ml石油醚(30℃~60℃)横展一次，展至板端过1min，取出通风挥干5min。
19.4.3.2纵展：在展开槽内倒入10ml纵展剂。将横展挥干后的薄层板置展开槽内纵展15cm，取出通风挥干10min，由于don与杂质分离的效果受空气湿度影响较大，当板面分离效果不太好时即第一块薄层板的试样点附近有杂质荧光干扰时，可按极性大小依次换用以下几种展开方式：
a)三氯（lv）甲烷-丙酮-异丙醇(8+1+1)。
b)三氯（lv）甲烷-丙酮-异丙醇(8+1+1)并在展开槽盖内面贴上水饱和的滤纸。
c)三氯（lv）甲烷-丙酮-异丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1)。
d)三氯（lv）甲烷-丙酮-异丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1)并在展开槽内面贴上水饱和的滤纸。改换纵展
方式，展开第二块薄层板。如展开槽内极性太大，会使don点变偏。
19.4.4显荧光：先观察未加热的薄层板可见到显蓝紫荧光的干扰点，这时don不显荧光，加热薄层板后，杂质点仍显荧光，它在don荧光点附近，但不干扰don。然后将此薄层板置130℃烘箱中加热7min~10min，取出放在冷的表面上1min~5min后于365nm紫外光灯下观察。
19.4.5观察与评定：薄层板经横展后，板上样液点的don点移动0.7cm~1.0cm，正是根据这一点在纵展后使样品don点摆脱了杂质荧光的干扰。薄层板上端未经纵展的三个don标准点可分别作为纵展后样品don点和两个don标准点的横向定位点。样品don点又可与纵展后的don标准点比较rf值而定性。这样从横向和纵向两个方面确定样品don的位置，达到定性的目的。在第一块薄层板上如样品don点上有很浅的斜的荧光通过，这是过柱时没有掌握好速度，净化不够，也可能是空气湿度的变化，影响分离效果，但两个标准don点的位置上均无杂质荧光干扰。如在第一块薄层板上样液未显荧光点，而在第二块薄层板上样液25μl加标准25ng所显荧光强度与标准25ng相等，则样品中don含量为阴性或为50μg/kg以下。阳性样品概略定量时，虽然薄层板上三个d（lv）on点在横展中都稍有移动，但对各点荧光强度无影响，两个标准点均可用于和样品don点比较荧光强度。
19.4.6薄层光密度计测定：激发光波长340nm、发射光波长400nm。在薄层板上标准don荧光点至少在100ng、200ng、400ng时，测得的响应与don的量才呈线性关系。对don含量在300μg/kg以上的样品才用光密度计测定。当don含量在300μg/kg时，点样液20μl使测得的don的量落在100ng~200ng之间。用薄层扫描仪测定时，每块薄层板上滴加两个标准don点，don的量为100ng、200ng或200ng、400ng。在激发波长340nm，发射波长400nm条件下进行测定，以测得的峰面积值为纵坐标，don量为横坐标，绘制标准曲线。
（lv）
20分析结果的表述
试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量按式(3)计算：
式中
x——试样中don的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c——薄层板上测得样品点上don的量，单位为纳克(ng)；
v1——加入三氯（lv）甲烷-乙腈混合液溶解残渣的体积，单位为毫升(ml)；
f——样液的总稀释倍数；
1000——换算系数；
v2——滴加样液的体积，单位为毫升(ml)；
m——三氯（lv）甲烷-乙腈混合液溶解残渣相当样品的质量，单位为克(g)。
结果表示到测定值的整数位。
don含量超过gb2761限（xian）量值的试样需用第一法作进一步确证。
21精密度
每个试样称取两份进行平行测定，以其算术平均值为分析结果。
其分析结果的相对相差应不大于60%。
22其他
薄层板上脱氧雪腐镰刀菌烯醇的最（zui）低检出量为100ng，检出限为300μg/kg。
第四法酶联免疫吸附筛查法
23原理
试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇经水提取、均质、涡旋、离心(或过滤)等前处理获取上清液。被酶标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇酶连偶合物，与试样上清液或标准品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争性结合微孔中预包被的特异性抗体。在洗涤后加入相应显色剂显色，经无机酸终止反应，于450nm或630nm波长下检测。试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇与吸光度在一定浓度范围内呈反比。
24试剂
配制溶液所需试剂均为分析纯，水为gb/t6682规定二级水。
按照所选用的试剂盒说明书描述，配制所需溶液。
25仪器和设备
25.1微孔板酶标仪：带450nm与630nm(可选)滤光片。
25.2研磨机。
25.3振荡器。
25.4电子天平：感量0.01g。
25.5离心机：转速≥6000r/min。
25.6快速定量滤纸：孔径11μm。
25.7筛网：1mm~2mm试验筛孔径。
25.8试剂盒所要求的其他仪器。
26分析步骤
26.1提取
称取至少100g样品，用研磨机进行粉碎，粉碎后的样品过1mm~2mm试验筛。取5.0g样品于50ml离心管中，加入试剂盒所要求提取液，按照试纸盒说明书所述方法进行检测。
26.2 elisa检测
按照酶联免疫试剂盒所述操作步骤对待测试样(液)进行定量检测。
27分析结果的表述
按照试剂盒说明书提供的计算方法或者计算机软件，根据标准品浓度与吸光度变化关系绘制标准工作曲线。
27.1待测液浓度计算
按照试剂盒说明书提供的计算方法以及计算机软件，将待测液吸光度代入绘制得到的标准工作曲线，计算得待测液浓度(ρx )。
27.2结果计算
食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量按式(4)计算：
式中：
x——食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
ρx——待测液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浓度，单位为微克每升(μg/l)；
v——提取液体积，单位为升(l)；
f——在前处理过程中的稀释倍数；
m——样品取样量，单位为千克(kg)。
计算结果保留到小数点后一位。
don含量超过gb2761限（xian）量值的试样需用第一法作进一步确证。
28精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的25%。
29其他
当称取谷物及其制品样品5g时，方法检出限为200μg/kg，定量限为250μg/kg。
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gb 5009.111-2016
食品安全国家标准
食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定
前言
本标准代替gb/t 5009.111-2003《谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》、gb/t 23503-2009《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、sn/t 1571-2005《进出口粮谷中呕吐毒素检验方法液相色谱法》。
本标准与gb/t 5009.111-2003相比，主要变化如下：
——标准名称修改为“食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定”；
——增加了方法的适用范围；
——增加了食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇乙酰化衍生物的测定；
——增加了同位素稀释液相色谱-串联质谱法；
——增加了固相萃取柱净化的前处理方式；
——增加了免疫亲和柱净化-高效液相色谱法；
——增加了商业化免疫亲和柱评价技术参数要求。
1范围
本标准规定了食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定方法。
第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法，适用于谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。
第二法为免疫亲和层析净化高效液相色谱法，适用于谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。
第三法为薄层色谱测定法，第四法为酶联免疫吸附筛查法，适用于谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。
第一法同位素稀释液相色谱-串联质谱法
2原理
试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇用水和乙腈的混合溶液提取，提取上清液经固相萃取柱或免疫亲和柱净化，浓缩、定容和过滤后，超高压液相色谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1乙腈(ch3cn)：色谱纯。
3.1.2甲醇(ch3oh)：色谱纯。
3.1.3正己烷(c6h14)。
3.1.4氨水(nh3·h2o)。
3.1.5甲酸(hcooh)。
3.1.6氮气(n2)：纯度≥99.9%。
3.2试剂配制
3.2.1乙腈-水溶液(84+16)：量取160ml水加入到840ml乙腈中，混匀。
3.2.2乙腈饱和的正己烷溶液：量取200ml正己烷于250ml分液漏斗中，加入少量乙腈，剧烈振摇数分钟，静置分层，弃去下层乙腈层即得。
3.2.3甲醇-水溶液(5+95)：量取5ml甲醇加入到95ml水中，混匀。
3.2.4 0.01%氨水溶液：取100μl氨水加入到1000ml水中，混匀(仅供离子源模式为esi-时使用)。
3.2.5 0.1%甲酸溶液：取1ml甲酸加入到1000ml水中，混匀(仅供离子源模式为esi+时使用)。
3.3标准品
3.3.1脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don，c15h20o6，cas号：51481-10-8)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2 3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-adon，c17h22o7，cas号：50722-38-8)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.3 15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-adon，c17h22o7，cas号：88337-96-6)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.413c15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇同位素标准溶液(13c-don，13c15h20o6)：25μg/ml，纯度≥99%。
3.3.513c17-3-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇同位素标准溶液(13c-3-adon，13c17h22o7)：25μg/ml，纯度≥99%。
3.4标准溶液配制
3.4.1标准储备溶液(100μg/ml)：分别称取don、3-adon和15-adon 1mg(准确至0.01mg)，分别用乙腈溶解并定容至10ml。将溶液转移至试剂瓶中，在-20℃下密封保存，有效期1年。
3.4.2混合标准工作溶液(10μg/ml)：准确吸取100μg/mldon、3-adon和15-adon标准储备液各1.0ml于同一10ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在-20℃下密封保存，有效期半年。
3.4.3混合同位素内标工作液(1μg/ml)：准确吸取13c15-don和13c17-3-adon同位素内标
(25μg/ml)各1ml于同一25ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在- 20℃下密封保存，有效期半年。
3.4.4标准系列工作溶液：准确移取适量混合标准工作溶液和混合同位素内标工作液，用初始流动相配制成10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml、320ng/ml、640ng/ml的混合标准系列，其中同位素内标浓度为100ng/ml。标准系列溶液于4℃保存，有效期7d。
4仪器和设备
4.1液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源。
4.2电子天平：感量0.01g和0.00001g。
4.3高速粉碎机：转速10000r/min。
4.4匀浆机。
4.5筛网：0.5mm~1mm孔径。
4.6超声波/涡旋振荡器或摇床。
4.7氮吹仪。
4.8高速离心机：转速不低于12000r/min。
4.9移液器：量程10μl~100μl和100μl~1000μl。
4.10固相萃取装置。
4.11通用型固相萃取柱：兼具亲水基团(吡咯烷酮基团)和疏水基团(二乙烯基苯)吸附剂填料的固相萃取小柱，200mg，6ml，或相当者。
4.12dons专用型固相净化柱，或相当者。
4.13脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱：柱容量≥1000ng(柱容量和柱回收率验证方法参见a.2)。
4.14水相微孔滤膜：0.22μm。
5分析步骤
5.1试样制备
5.1.1谷物及其制品：取至少1kg样品，用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于0.5mm~1mm孔径试验筛，混合均匀后缩分至100g，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。
5.1.2酒类：取散装酒至少1l，对于袋装、瓶装等包装样品至少取3个包装(同一批次或号)，将所有液体试样在一个容器中用均质机混匀后，缩分至100g(ml)储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。含二氧化碳的酒类样品使用前应先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气后方可使用。
5.1.3酱油、醋、酱及酱制品：取至少1l样品，对于袋装、瓶装等包装样品至少取3个包装(同一批次或号)，将所有液体样品在一个容器中用匀浆机混匀后，缩分至100g(ml)储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。
5.2试样提取
5.2.1谷物及其制品：称取2g(准确至0.01g)试样于50ml离心管中，加入400μl混合同位素内标工作液振荡混合后静置30min。加入20.0ml乙腈-水溶液(84+16)，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min。10000r/min离心5min，收集上清液a于干净的容器中备用。
5.2.2酒类：称取5g(准确至0.01g)试样于50ml离心管中，加入200μl混合同位素内标工作液振荡混合后静置30 min，用乙腈定容至10 ml，混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min。10000r/min离心5min，收集上清液b于干净的容器中备用。
5.2.3酱油、醋、酱及酱制品：称取2g(准确至0.01g)试样于50ml离心管中，加入400μl混合同位素内标工作液振荡混合后静置30min。加入20.0ml乙腈-水溶液(84+16)，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min。10000r/min离心5min，收集上清液c于干净的容器中备用。
5.3试样净化
注：下述试样的净化方法，可根据实际情况，选择其中一种方法即可。
5.3.1通用型固相萃取柱净化
取5ml上清液a或上清液b或上清液c置于50ml离心管中，加入10ml乙腈饱和正己烷溶液，涡旋混合2min，5000r/min离心2min，弃去正己烷层后，于40℃~50℃下氮气吹干，加入4ml水充分溶解残渣，待净化。
将固相萃取柱连接到固相萃取装置，先后用3ml甲醇和3ml水活化平衡。将4ml上述水复溶液上柱，控制流速为每秒1滴~2滴。用3ml水、1ml5%甲醇-水溶液依次淋洗柱子后彻（che）底抽干。用4ml甲醇洗脱，收集全部洗脱液后在40℃~50℃下氮气吹干。加入1.0ml初始流动相溶解残留物，涡旋混匀10s，用0.22μm微孔滤膜过滤于进样瓶中，待进样。
5.3.2 dons专用型固相净化柱净化
取8ml上清液a或上清液b或上清液c至dons专用型固相净化柱的玻璃管内，将净化柱的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管至净化液析出，移取5ml净化液于40℃~50℃下氮气吹干。加入1.0ml初始流动相溶解残留物，涡旋混匀10s，用0.22μm微孔滤膜过滤于进样瓶中，待进样。
5.3.3免疫亲和柱净化
事先将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。
准确移取5ml上清液a或上清液b或上清液c，于40℃~50℃下氮气吹干，加入2ml水充分溶解残渣，待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液移至玻璃注射器筒中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节下滴速度，控制样液以每秒1滴的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。用5ml pbs缓冲盐溶液和5ml水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为每秒1滴~2滴，直至空气进入亲和注中，弃去全部流出液，抽干小柱。
准确加入2ml甲醇洗脱亲和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脱液至试管中，在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0ml初始流动相，涡旋30s溶解残留物，0.22μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。
注：使用不同厂商的免疫亲和柱，在样品上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同，应该按照说明书要求进行操作。
5.4液相色谱-串联质谱参考条件(可根据实际情况参考其中一种方法即可)
5.4.1离子源模式：esi+液相色谱-质谱参考条件列出如下：
a)液相色谱柱：c18柱(柱长100mm，柱内径2.1mm；填料粒径1.7μm)，或相当者；
b)流动相：a相：0.1%甲酸溶液；b相：0.1%甲酸-乙腈；
c)梯度洗脱：2% b (0 min~0.8 min)，24% b (3.0 min~4.0 min)，100% b (6.0 min~
6.9min)，2% b(6.9min~7.0min)；
d)流速：0.35ml/min；
e)柱温：40℃；
f)进样体积：10μl；
g)毛细管电压：3.5kv；锥孔电压：30v；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：900l/h；
h)脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物质谱条件参考表1。
5.4.2离子源模式：esi-液相色谱-质谱参考条件列出如下：
a)液相色谱柱：c18柱(柱长100mm，柱内径2.1mm；填料粒径1.7μm)，或相当者；
b)流动相：a相：0.01%氨水溶液；b相：乙腈；
c)梯度洗脱：2% b(0min~0.8min)，24% b(3.0min~4.0min)，100% b(6.0min~6.9min)，
2% b(6.9min~7.0min)；
d)流速：0.35ml/min；
e)柱温：40℃；
f)进样体积：10μl；
g)毛细管电压：2.5kv；锥孔电压：45v；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：900l/h；
h)脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物质谱条件参考表2。
各化合物的离子扫描图、多反应监测(mrm)离子通道图参见图b.1~图b.8。
5.5定性测定
试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5%之内。
每种化合物的质谱定性离子应出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表3规定的范围。
5.6标准曲线的制作
在5.4液相色谱串联质谱仪分析条件下，将标准系列溶液由低到高浓度进样检测，以don、3-adon和15-adon色谱峰与各对应内标色谱峰的峰面积比值-浓度作图，得到标准曲线回归方程，其线性相关系数应大于0.99。
5.7试样溶液的测定
取5.2、5.3处理得到的待测溶液进样，内标法计算待测液中目标物质的质量浓度，按6计算样品中待测物的含量。试液中待测物的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应适当减少取样量后重新测定。
5.8空白试验
除不加试样外，按5.3和5.4的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。
6分析结果的表述
试样中don、3-adon或15-adon的含量按式(1)计算：
式中：
x——试样中don、3-adon或15-adon的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
ρ——试样中don、3-adon或15-adon按照内标法在标准曲线中对应的质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
v1——试样提取液体积，单位为毫升(ml)；
v3——试样最终定容体积，单位为毫升(ml)；
1000——换算系数；
v2——用于净化的分取体积，单位为毫升(ml)；
m——试样的称样量，单位为克(g)。
计算结果保留三位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的23%。
8其他
当称取谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品试样2g时，方法中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇检出限为10μg/kg，定量限为20μg/kg。
当称取酒类试样5g时，方法中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇检出限为5μg/kg，定量限为10μg/kg。
第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法
9原理
试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇用水提取，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱-紫外检测器测定，外标法定量。
10试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t6682规定的一级水。
10.1试剂
10.1.1甲醇(ch3oh)：色谱纯。
10.1.2乙腈(ch3cn)：色谱纯。
10.1.3聚乙二醇[相对分子质量为8000，ho(ch2ch2o)nh]。
10.1.4氯化钠(nacl)。
10.1.5磷酸氢二钠(na2hpo4)。
10.1.6磷酸二氢钾(kh2po4)。
10.1.7氯（lv）化钾(kcl)。
10.1.8盐酸(hcl)。
10.2试剂配制
10.2.1磷酸盐缓冲溶液(以下简称pbs)：称取8.00g氯化钠、1.20g磷酸氢二钠、0.20g磷酸二氢钾、0.20g氯（lv）化钾，用900ml水溶解，用盐酸调节ph至7.0，用水定容至1000ml。
10.2.2甲醇-水溶液(20+80)：量取200ml甲醇加入到800ml水中，混匀。
10.2.3乙腈-水溶液(10+90)：量取100ml乙腈加入到900ml水中，混匀。
10.3标准品
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(c15h20o6，cas号：51481-10-8)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4标准溶液配制
10.4.1标准储备溶液(100μg/ml)：称取脱氧雪腐镰刀菌烯醇1mg(准确至0.01mg)，用乙腈溶解并定容至10ml。将溶液转移至试剂瓶中，在-20℃下密封保存，有效期1年。
10.4.2标准系列工作溶液：准确移取适量脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准储备溶液用初始流动相稀释，配制成100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、5000ng/ml的标准系列工作液，4℃保存，有效期7d。
11仪器和设备
11.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。
11.2电子天平：感量0.01g和0.00001g。
11.3高速粉碎机：转速10000r/min。
11.4筛网：1mm~2mm孔径。
11.5超声波/涡旋振荡器或摇床。
11.6氮吹仪。
11.7高速离心机：转速≥12000r/min。
11.8移液器：量程10μl~100μl和100μl~1000μl。
11.9脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱：柱容量≥1000ng(柱容量和柱回收率验证方法参见a.2)。
注：对于不同批次的亲和柱在使用前需质量验证。
11.10玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5μm。
11.11水相微孔滤膜：0.45μm。
11.12聚丙烯刻度离心管：具塞，50ml。
11.13玻璃注射器：10ml。
11.14空气压力泵。
12分析步骤
使用不同厂商的免疫亲和柱，在试样上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同，应该按照说明书要求进行操作。
12.1试样制备
同5.1。
12.2试样提取
12.2.1谷物及其制品：称取25g(准确到0.1g)磨碎的试样于100ml具塞三角瓶中加入5g聚乙二醇，加水100ml，混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min。以玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清(或6000r/min下离心10min)，收集滤液a于干净的容器中。10000r/min离心5min。
12.2.2酒类：取酒样20g(准确到0.1g)，加入1g聚乙二醇，用水定容至25.0ml，混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min。用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清(或6000r/min下离心10min)，收集滤液b于干净的容器中。
12.2.3酱油、醋、酱及酱制品：称取样品25g(准确到0.1g)，加入5g聚乙二醇，用水定容至100ml，混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20 min。以玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清(或6000r/min下离心10min)，收集滤液c于干净的容器中。
12.3净化
事先将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液移至玻璃注射器筒中，准确移取上述滤液a或滤液b或滤液c2.0ml，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节下滴速度，控制样液以每秒1滴的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。用5mlpbs缓冲盐溶液和5ml水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为每秒1滴~2滴，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。
12.4洗脱
准确加入2ml甲醇洗脱亲和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脱液至试管中，在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0ml初始流动相，涡旋30s溶解残留物，0.45μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。
12.5液相色谱参考条件
液相色谱参考条件列出如下：
a)液相色谱柱：c18柱(柱长150mm，柱内径4.6mm；填料粒径5μm)，或相当者；
b)流动相：甲醇+水(20+80)；
c)流速；0.8ml/min；
d)柱温：35℃；
e)进样量：50μl；
f)检测波长：218nm。
12.6定量测定
12.6.1标准曲线的制作
以脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准工作液浓度为横坐标，以峰面积积分值纵坐标，将系列标准溶液由低到高浓度依次进样检测，得到标准曲线回归方程。
12.6.2试样溶液的测定
试样液中待测物的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应适当减少称样量，重新按12.2、12.3和12.4进行处理后再进样分析。
12.7空白试验
除不称取试样外，按12.2、12.3和12.4做空白试验。确认不含有干扰待测组分的物质。
13分析结果的表述
试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量按式(2)计算：
式中：
x——试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
ρ1——试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的质量浓度，单位纳克每毫升(ng/ml)；
ρ0——空白试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的质量浓度，单位纳克每毫升(ng/ml)；
v——样品洗脱液的最终定容体积，单位毫升(ml)；
f——样液稀释因子；
1000——换算系数；
m——试样的称样量，单位克(g)。
计算结果保留三位有效数字。
14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的23%。
15其他
当称取谷物及其制品、酱油、醋、酱及酱制品试样25g时，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检出限为100μg/kg，定量限为200μg/kg；当称取酒类试样20g时，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检出限为50μg/kg，定量限为100μg/kg。
第三法薄层色谱测定法
16原理
试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇经提取、净化、浓缩和硅胶g薄层展开后，加热薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板时加入了三氯化铝，使脱氧雪腐镰刀菌烯醇在365nm紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较。
17试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。
17.1试剂
17.1.1三氯（lv）甲烷(chcl3)。
17.1.2无水乙醇(ch3ch2oh)。
17.1.3甲醇(ch3oh)。
17.1.4石油醚(cnh2n+2)。
17.1.5乙酸乙酯(ch3cooch2ch3)。
17.1.6乙腈(ch3cn)。
17.1.7丙酮(ch3coch3)。
17.1.8异丙醇(ch3ch2ohch3)。
17.1.9乙（yi）醚(ch3ch2och2ch3)。
17.1.10氯化铝(alcl3·6h2o)：化学纯。
17.1.11中性氧化铝：经300℃活化4h，置干燥器中备用。
17.1.12活性炭：20g活性炭，用3mol/l盐酸溶液浸泡过夜，抽滤后，用热蒸馏水洗至无氯离子，在120℃烘干备用。
17.1.13硅胶g：薄层层析用。
17.2标准品
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(c15h20o6，cas号：51481-10-8)：纯度≥99%。
17.3标准溶液配制
标准储备溶液(25μg/ml)：称取脱氧雪腐镰刀菌烯醇5.0mg(准确到0.1mg)，加乙酸乙酯-甲醇(19+1)溶解，转入10ml容量瓶中，并定容至10ml。吸取此溶液0.5ml，用乙酸乙酯-甲醇(19+1)稀释至10ml。
18仪器和设备
18.1小型粉碎机。
18.2电动振荡器。
18.3玻璃蒸发皿：75ml。
18.4层析柱：内径2cm，长10cm，不具活塞。
18.5具塞浓缩瓶：10ml，底部具0.2ml刻度尾管。
18.6玻璃板：5cm×20cm。
18.7薄层涂布器：0.3mm。
18.8展开槽：内长26cm，宽6cm，高4cm。
18.9紫外光灯：365nm。
18.10微量注射器：10μl，50μl。
18.11平底管：50ml。
18.12双波长薄层扫描仪：带数据处理机。
19分析步骤
19.1试样提取
称取20g粉碎试样置于200ml具塞锥瓶中，加8ml和100ml三氯（lv）甲烷-无水乙醇(8+2)，密
塞。在瓶塞上涂层水，盖严防漏，振荡1h，通过折叠快速定性滤纸过滤，取25ml滤液于75ml玻璃蒸发皿中，置90℃水浴上通风挥干。
19.2净化
19.2.1液-液分配
19.2.1.1谷物：用50ml石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入100ml分液漏斗中，再用20ml(玉米试样用30ml)甲醇-水(4+1)分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中。
19.2.1.2谷物制品(蛋糕、饼干、面包等)：用100ml石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入250ml分液漏斗中，再用30ml甲醇-水(4+1)分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中。振荡分液漏斗1.5min，静置约15min使分层后，将下层甲醇-水提取液过柱净化，不要将两相交界处的白色絮状物放入柱内。
19.2.2柱净化
19.2.2.1小麦及其制品：在层析柱下端与小管连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加0.4g活性炭，敲紧。将层析柱下端小管插入一橡皮塞，塞在抽滤瓶上，抽滤瓶中放一平底管接受过柱液，将抽滤瓶接上水泵或真空泵，稍稍开启泵，使活性炭压紧，将分液漏斗中的甲醇-水提取液小心地沿管壁加入柱内，控制流速为每15秒18滴~20滴(3ml/min)，甲醇-水提取液过柱快完毕时，加入10ml甲醇-水(4+1)淋洗柱，抽滤，直至柱内不再有液体流出。过柱速度控制在2ml/min~3ml/min，速度太快净化效果不好，太慢耗时太长。
19.2.2.2玉米：同20.2.2.1，只是将活性炭的用量改为0.3g。
19.3制备薄层层析用样液
将过柱后的洗脱液倒入75ml玻璃蒸发皿中，用少量甲醇-水(4+1)洗涤平底管。将蒸发皿置沸水浴上浓缩至干：
a)小麦：趁热加入3ml乙酸乙酯，加热至沸，在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次，使充分沸腾将残渣中的don溶出，并将乙酸乙酯挥发至干，再加入3ml乙酸乙酯同样处理一次，将溶剂挥干，最后加3ml乙酸乙酯，加热至沸，放冷至室温后转入浓缩瓶中，再用3份1.5ml乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。
b)小麦制品和玉米：趁热加入3ml乙酸乙酯，加热至沸，在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次，使充分沸腾，将残渣中don溶出，放冷至室温后转入浓缩瓶中。加约0.5ml甲醇-丙酮(1+2)于蒸发皿中，用玻璃搅动溶解残渣，将蒸发皿置水浴锅上挥干溶剂后，加入3ml乙酸乙酯，加热至沸，转动蒸发皿，使充分沸腾，放冷至室温后转入同一浓缩瓶中，再用0.5ml甲醇-丙酮(1+2)和3ml乙酸乙酯同样处理一次，乙酸乙酯提取液并入浓缩瓶中。
将浓缩瓶置约95℃水浴锅上，用蒸汽加热吹氮气浓缩至干，放冷至室温后加入0.2ml三氯（lv）甲烷-乙腈(4+1)溶解残渣留作薄层层析用。
19.4测定
19.4.1薄层板的制备：4g硅胶g加约9ml15%氯化铝(alcl3·6h2o)水溶液，研磨约2min至呈黏稠状，铺成5cm×20cm的薄层板三块，置室温干燥后，于105℃活化1h，贮干燥器中备用。
19.4.2点样：在每块薄层板上距下端2.5cm的基线上点样。
第一块板：对每一个试样先点第一块薄层板，在距板左边缘1.8cm处点25μl试样液，在距板上端1.5cm处的横线上并与基线试样点相对应的位置上点2μldon标准液(50ng)。
第二块板：在第一块板上未显荧光的试样则需在第二块薄层板上距左边缘0.8cm~1cm处滴加样液点(根据情况估计滴加量，或稀释后定量)，在距板左边缘2cm处和在距右边缘1.2cm处分别滴加两个标准点，don的量可为50ng、75ng、100ng。再在距板上端1.5cm处的横线上点三个don标准点(各50ng)，使之与基线上的三个点相对应。
19.4.3展开：
横展剂：乙（yi）醚、乙（yi）醚-丙酮(95+5)或无水乙（yi）醚。任选其中一种，使试样don点偏离原点0.7cm~1cm，刚好与杂质荧光分开。
纵展剂：三氯（lv）甲烷-丙酮-异丙醇(8+1+1)；
三氯（lv）甲烷-丙酮-异丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1)。
19.4.3.1横展：在展开槽内倒入10ml横展剂。将点好样的薄层板靠样液点的长边斜浸入溶剂，展至板端1min~2min，取出通风挥干3min。对小麦制品还须再用10ml石油醚(30℃~60℃)横展一次，展至板端过1min，取出通风挥干5min。
19.4.3.2纵展：在展开槽内倒入10ml纵展剂。将横展挥干后的薄层板置展开槽内纵展15cm，取出通风挥干10min，由于don与杂质分离的效果受空气湿度影响较大，当板面分离效果不太好时即第一块薄层板的试样点附近有杂质荧光干扰时，可按极性大小依次换用以下几种展开方式：
a)三氯（lv）甲烷-丙酮-异丙醇(8+1+1)。
b)三氯（lv）甲烷-丙酮-异丙醇(8+1+1)并在展开槽盖内面贴上水饱和的滤纸。
c)三氯（lv）甲烷-丙酮-异丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1)。
d)三氯（lv）甲烷-丙酮-异丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1)并在展开槽内面贴上水饱和的滤纸。改换纵展
方式，展开第二块薄层板。如展开槽内极性太大，会使don点变偏。
19.4.4显荧光：先观察未加热的薄层板可见到显蓝紫荧光的干扰点，这时don不显荧光，加热薄层板后，杂质点仍显荧光，它在don荧光点附近，但不干扰don。然后将此薄层板置130℃烘箱中加热7min~10min，取出放在冷的表面上1min~5min后于365nm紫外光灯下观察。
19.4.5观察与评定：薄层板经横展后，板上样液点的don点移动0.7cm~1.0cm，正是根据这一点在纵展后使样品don点摆脱了杂质荧光的干扰。薄层板上端未经纵展的三个don标准点可分别作为纵展后样品don点和两个don标准点的横向定位点。样品don点又可与纵展后的don标准点比较rf值而定性。这样从横向和纵向两个方面确定样品don的位置，达到定性的目的。在第一块薄层板上如样品don点上有很浅的斜的荧光通过，这是过柱时没有掌握好速度，净化不够，也可能是空气湿度的变化，影响分离效果，但两个标准don点的位置上均无杂质荧光干扰。如在第一块薄层板上样液未显荧光点，而在第二块薄层板上样液25μl加标准25ng所显荧光强度与标准25ng相等，则样品中don含量为阴性或为50μg/kg以下。阳性样品概略定量时，虽然薄层板上三个d（lv）on点在横展中都稍有移动，但对各点荧光强度无影响，两个标准点均可用于和样品don点比较荧光强度。
19.4.6薄层光密度计测定：激发光波长340nm、发射光波长400nm。在薄层板上标准don荧光点至少在100ng、200ng、400ng时，测得的响应与don的量才呈线性关系。对don含量在300μg/kg以上的样品才用光密度计测定。当don含量在300μg/kg时，点样液20μl使测得的don的量落在100ng~200ng之间。用薄层扫描仪测定时，每块薄层板上滴加两个标准don点，don的量为100ng、200ng或200ng、400ng。在激发波长340nm，发射波长400nm条件下进行测定，以测得的峰面积值为纵坐标，don量为横坐标，绘制标准曲线。
（lv）
20分析结果的表述
试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量按式(3)计算：
式中
x——试样中don的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c——薄层板上测得样品点上don的量，单位为纳克(ng)；
v1——加入三氯（lv）甲烷-乙腈混合液溶解残渣的体积，单位为毫升(ml)；
f——样液的总稀释倍数；
1000——换算系数；
v2——滴加样液的体积，单位为毫升(ml)；
m——三氯（lv）甲烷-乙腈混合液溶解残渣相当样品的质量，单位为克(g)。
结果表示到测定值的整数位。
don含量超过gb2761限（xian）量值的试样需用第一法作进一步确证。
21精密度
每个试样称取两份进行平行测定，以其算术平均值为分析结果。
其分析结果的相对相差应不大于60%。
22其他
薄层板上脱氧雪腐镰刀菌烯醇的最（zui）低检出量为100ng，检出限为300μg/kg。
第四法酶联免疫吸附筛查法
23原理
试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇经水提取、均质、涡旋、离心(或过滤)等前处理获取上清液。被酶标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇酶连偶合物，与试样上清液或标准品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争性结合微孔中预包被的特异性抗体。在洗涤后加入相应显色剂显色，经无机酸终止反应，于450nm或630nm波长下检测。试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇与吸光度在一定浓度范围内呈反比。
24试剂
配制溶液所需试剂均为分析纯，水为gb/t6682规定二级水。
按照所选用的试剂盒说明书描述，配制所需溶液。
25仪器和设备
25.1微孔板酶标仪：带450nm与630nm(可选)滤光片。
25.2研磨机。
25.3振荡器。
25.4电子天平：感量0.01g。
25.5离心机：转速≥6000r/min。
25.6快速定量滤纸：孔径11μm。
25.7筛网：1mm~2mm试验筛孔径。
25.8试剂盒所要求的其他仪器。
26分析步骤
26.1提取
称取至少100g样品，用研磨机进行粉碎，粉碎后的样品过1mm~2mm试验筛。取5.0g样品于50ml离心管中，加入试剂盒所要求提取液，按照试纸盒说明书所述方法进行检测。
26.2 elisa检测
按照酶联免疫试剂盒所述操作步骤对待测试样(液)进行定量检测。
27分析结果的表述
按照试剂盒说明书提供的计算方法或者计算机软件，根据标准品浓度与吸光度变化关系绘制标准工作曲线。
27.1待测液浓度计算
按照试剂盒说明书提供的计算方法以及计算机软件，将待测液吸光度代入绘制得到的标准工作曲线，计算得待测液浓度(ρx )。
27.2结果计算
食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量按式(4)计算：
式中：
x——食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
ρx——待测液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浓度，单位为微克每升(μg/l)；
v——提取液体积，单位为升(l)；
f——在前处理过程中的稀释倍数；
m——样品取样量，单位为千克(kg)。
计算结果保留到小数点后一位。
don含量超过gb2761限（xian）量值的试样需用第一法作进一步确证。
28精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的25%。
29其他
当称取谷物及其制品样品5g时，方法检出限为200μg/kg，定量限为250μg/kg。
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