碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定原理
实验原理
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ec 3.1.3.1简称为alpase）广泛存于微生物界和动物界。alpase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中，alpase起了及其重要的作用。在生物体内alpase与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。alpase的作用适ph在碱性区域，一般在ph9.0~10.5范围内。mg2+对该酶的活力有显著的激活使用。
为了获得好的提取效果，在酶的制备过程，特别应注意以下几点：
选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是常用的盐。操作时，要注意保持缓冲液的合适ph值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细，需缓慢加入并及时搅拌溶解，尽量防止泡沫形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀，要静置20min以上，以使沉淀*，然后方可时行离心分离。有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作，缓慢加入，充分搅拌，避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后，立即将其溶于适量缓冲液中，以避免酶活力的丧失。在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步聚才有效。酶活力的分析：通常是以对—硝基苯磷酸二纳（pnpp)为底物，在ph10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/l mg2+）的测活体系中检测酶催化pnpp水解产生黄色的对硝基苯（ pnp）在405 nm处有大的吸收峰，可以根据od4〇5值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下，以5mmol/l pnpp为底物，在ph 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/l mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 mol/l pnp的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。
蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(folin-phenolreagem)显色法，详见北京来亨科贸有限责任公司技术文章。
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为了获得好的提取效果，在酶的制备过程，特别应注意以下几点：
选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是常用的盐。操作时，要注意保持缓冲液的合适ph值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细，需缓慢加入并及时搅拌溶解，尽量防止泡沫形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀，要静置20min以上，以使沉淀*，然后方可时行离心分离。有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作，缓慢加入，充分搅拌，避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后，立即将其溶于适量缓冲液中，以避免酶活力的丧失。在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步聚才有效。酶活力的分析：通常是以对—硝基苯磷酸二纳（pnpp)为底物，在ph10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/l mg2+）的测活体系中检测酶催化pnpp水解产生黄色的对硝基苯（ pnp）在405 nm处有大的吸收峰，可以根据od4〇5值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下，以5mmol/l pnpp为底物，在ph 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/l mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 mol/l pnp的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。
蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(folin-phenolreagem)显色法，详见北京来亨科贸有限责任公司技术文章。
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