实战经验丨竞争性ELISA：受体蛋白包被浓度及配体蛋白-Tag饱和浓度的确定
劲马是一家业经营生物试剂、科研仪器、生物试剂、实验耗材的公司，主要经营elisa试剂盒，血清，抗体，标准品，生物试剂，实验耗材，培养基及实验外包等，产品畅销国内大部分地区，覆盖面广，产品齐全，价格实惠，服务周到。我司拥有雄厚的实力、合理的价格和完善的服务，能够及时解决和满足客户的各方面的需求，与国内多家企业建立了良好的长期合作关系，在市场上树立了公司的良好信誉和形象。
01
·tag饱和浓度的确定：
1. 包被：用1×包被液将受体蛋白稀释若干个浓度（如2 µg/ml、1 µg/ml、0.5 µg/ml），每孔加入100µl包被液，4℃包被过夜（确定最佳包被浓度）；
2. 洗涤：弃去（或回收）板内液体，用pbst洗涤液（0.05%吐温20）每孔200µl，每次洗涤3min，洗涤3次，拍干；
3. 封闭：加入封闭液（1%bsa溶液），每孔200 µl，保鲜膜包裹酶标板，放置于37℃水浴锅中，水浴1h；
4. 配制配体蛋白-tag溶液：用样品稀释液将配体蛋白-tag稀释至1 µg/ml（稀释液为0.5% bsa），3倍系列稀释，共10个梯度（封闭结束前半小时，防止样品变质）；
5. 加样：每孔加入100 µl配制好的配体蛋白-tag溶液，保鲜膜包裹后，放置于37℃水浴锅中水浴2h；
6. 洗涤：弃去板内液体，用pbst洗涤液每孔200µl，每次洗涤3min，洗涤3次，拍干。
7. 加酶标二抗：每孔加入100 µl二抗溶液（稀释液为0.5% bsa），37℃水浴锅中水浴1.5 h；
8. 洗涤：弃去板内液体，用pbst洗涤液每孔200µl，每次洗涤3min，洗涤5次，拍干；
9. 显色：每孔加入100µl显色液（tmb），显色15 min；
10. 终止：每孔加入50 µl 10%硫酸终止；
11. 检测：酶标仪检测od450和od630的吸光度值。
注：最终依据拟合的浓度-吸光度曲线，确定合适的受体蛋白包被浓度，并且同时确定该包被浓度下的配体蛋白饱和浓度。
02
1. 用先前确定的最佳的受体蛋白包被浓度包被板子，同上述条件洗涤，封闭；
2. 配置不同起始浓度的待测抗体：用样品稀释液将待测抗体稀释若干个浓度（如80 µg/ml、40 µg/ml、20 µg/ml、10 µg/ml），再将上述稀释液进行3倍稀释，共10个梯度（封闭结束前半小时，防止样品变质）；
3. 在受体蛋白包被板中加入2倍饱和浓度的配体蛋白-tag溶液，每孔50 µl，立即加入50 µl系列稀释的待测抗体，保鲜膜包裹后，放置于37℃水浴锅中水浴2h；
4. 洗涤：弃去板内液体，用pbst洗涤液每孔200µl，每次洗涤3min，洗涤3次，拍干。
5. 加酶标二抗：每孔加入100 µl二抗溶液（稀释液为0.5% bsa），37℃水浴锅中水浴1.5 h；
6. 洗涤：弃去板内液体，用pbst洗涤液每孔200µl，每次洗涤3min，洗涤5次，拍干；
7. 显色：每孔加入100µl显色液（tmb），显色15 min；
8. 终止：每孔加入50 µl 10%硫酸终止；
9. 检测：酶标仪检测od450和od630的吸光度值。
总结
elisa实验是实验室十分常规的检测手段，总体操作难度不大，但由于操作步骤繁多，且结果较为灵敏，容易出现结果差异较大的现象，因此需要格外注意上样的顺序及加样量，以保证尽可能缩小误差。竞争性elisa较普通elisa实验额外多出一个实验组分，需要在开展正式实验之前尽可能多摸索几个各个组分的工作浓度，以保证最终的结果在较好的范围内呈现。
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2. 洗涤：弃去（或回收）板内液体，用pbst洗涤液（0.05%吐温20）每孔200µl，每次洗涤3min，洗涤3次，拍干；
3. 封闭：加入封闭液（1%bsa溶液），每孔200 µl，保鲜膜包裹酶标板，放置于37℃水浴锅中，水浴1h；
4. 配制配体蛋白-tag溶液：用样品稀释液将配体蛋白-tag稀释至1 µg/ml（稀释液为0.5% bsa），3倍系列稀释，共10个梯度（封闭结束前半小时，防止样品变质）；
5. 加样：每孔加入100 µl配制好的配体蛋白-tag溶液，保鲜膜包裹后，放置于37℃水浴锅中水浴2h；
6. 洗涤：弃去板内液体，用pbst洗涤液每孔200µl，每次洗涤3min，洗涤3次，拍干。
7. 加酶标二抗：每孔加入100 µl二抗溶液（稀释液为0.5% bsa），37℃水浴锅中水浴1.5 h；
8. 洗涤：弃去板内液体，用pbst洗涤液每孔200µl，每次洗涤3min，洗涤5次，拍干；
9. 显色：每孔加入100µl显色液（tmb），显色15 min；
10. 终止：每孔加入50 µl 10%硫酸终止；
11. 检测：酶标仪检测od450和od630的吸光度值。
注：最终依据拟合的浓度-吸光度曲线，确定合适的受体蛋白包被浓度，并且同时确定该包被浓度下的配体蛋白饱和浓度。
02
1. 用先前确定的最佳的受体蛋白包被浓度包被板子，同上述条件洗涤，封闭；
2. 配置不同起始浓度的待测抗体：用样品稀释液将待测抗体稀释若干个浓度（如80 µg/ml、40 µg/ml、20 µg/ml、10 µg/ml），再将上述稀释液进行3倍稀释，共10个梯度（封闭结束前半小时，防止样品变质）；
3. 在受体蛋白包被板中加入2倍饱和浓度的配体蛋白-tag溶液，每孔50 µl，立即加入50 µl系列稀释的待测抗体，保鲜膜包裹后，放置于37℃水浴锅中水浴2h；
4. 洗涤：弃去板内液体，用pbst洗涤液每孔200µl，每次洗涤3min，洗涤3次，拍干。
5. 加酶标二抗：每孔加入100 µl二抗溶液（稀释液为0.5% bsa），37℃水浴锅中水浴1.5 h；
6. 洗涤：弃去板内液体，用pbst洗涤液每孔200µl，每次洗涤3min，洗涤5次，拍干；
7. 显色：每孔加入100µl显色液（tmb），显色15 min；
8. 终止：每孔加入50 µl 10%硫酸终止；
9. 检测：酶标仪检测od450和od630的吸光度值。
总结
elisa实验是实验室十分常规的检测手段，总体操作难度不大，但由于操作步骤繁多，且结果较为灵敏，容易出现结果差异较大的现象，因此需要格外注意上样的顺序及加样量，以保证尽可能缩小误差。竞争性elisa较普通elisa实验额外多出一个实验组分，需要在开展正式实验之前尽可能多摸索几个各个组分的工作浓度，以保证最终的结果在较好的范围内呈现。
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