流式细胞仪
细胞凋亡的检测方法众多，流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。因此，具有其它方法*的优越性。本文主要结合我室的一些实际经验，力图简单明了的介绍流式在检测凋亡方面的应用。
下面是一幅凋亡过程图。在凋亡诱导剂的作用下，首先是*和apa f－1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰*外翻，这时细胞的形态已经发生了改变，可以看到细胞变小，胞核皱缩；后是细胞内dna断裂，形成凋亡小体。
在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，我室曾经检测过的方法包括：
1：线粒体功能
2：dna cycle
3：caspases
4：annexin v assay
6：dna fragmentation assays
基本上涵盖了细胞凋亡的各个期，对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。
线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为bvk250）和bd公司出售的盒apo-alert试剂盒。其检测主要采用阳离子型荧光染料。原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。可以在荧光显微镜下，或流式检测。采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。
caspase家族可以检测的分子非常多，也有不少商业的试剂盒可以应用。即使没有相应的试剂盒，只要有相应抗体基本上是可以检测的，具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤。
在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰*（ps）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。annexin－v是一种35－36 kd的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对ps具有较高的亲和力。细胞凋亡时，可以和外翻的ps结合，从而可以检测凋亡的细胞。发生死亡的细胞其细胞膜上的ps也外翻，因而也会阳性。因此，常用的凋亡试剂盒除了采用annexin－v标记之外，还会加一种dna染料，常用的有pi和7－aad，由于死亡的细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和dna结合，从而可以发荧光，区分出死细胞。
下图给出的是在使用fas单抗诱导前后的检测结果，横坐标是annexin-v fitc, 纵坐标是pi，左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细胞，左下象限是存活的细胞，右下象限是凋亡的细胞。
在采用annixin v方法检测凋亡细胞时，要特别强调一点：该方法适用于悬浮生长的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞，由于在*等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较高的假阳性，从而影响检测结果。尽管目前，包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。我不*用该方法检测。因为其重复性较差，且需要操作时非常小心。
dna周期检测原本是用来反应细胞各个期，即细胞增殖状况的。利用细胞内dna能够和荧光染料，如pi，结合的特性。细胞各个期由于其dna含量不同从而结合的荧光染料不同，流式检测的荧光轻度也不一样。g2－m期dna含量是g0－g1的两倍，而s期介与两者之间。
但是由于发现凋亡的细胞dna含量较少，因而可以在细胞g0－g1期前面有一个亚二倍体峰，从而认为是凋亡细胞。但是由于死亡的细胞本身其dna含量也是减少的，因而非常难于区分凋亡和死亡的细胞。在90年代，该方法曾经风靡一时，现在看来，那时的实验结果需要推敲。尽管，经典的流式检测资料给出的图是认为凋亡的细胞是紧挨着g0－g1期峰的一个峰，死亡的细胞峰离g0－g1期峰较远，但是这种典型的结果似乎很难获得。有其它的替代方法，*可以不用这种方法。
下图横轴代表pi的荧光强度，纵轴代表细胞数目，各个期根据荧光强度可以简单的进行区分。
晚期凋亡的细胞由于dna的断裂，因而可以出现dna ladder，从而也就有了经典的检测方法tunel。流式也能也能进行tunel检测，其检测原理与经典tunel原理基本一致。以bd公司的为例，其利用tdt能将荧光素标记的dutp标记到断裂的dna末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。但是由于在细胞内标记，细胞需要进行固定处理，操作类似免疫组织化学法，容易造成假阳性。建议采用原装大厂的试剂盒，并且严格的设立对照。经过预实验方法稳定后再进行大规模实验。标本处理后，均可以用荧光纤维镜进行观察，拍照。流式检测后，可以进行的计算凋亡百分比。这一点，经典tunel是做不到的。
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在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，我室曾经检测过的方法包括：
1：线粒体功能
2：dna cycle
3：caspases
4：annexin v assay
6：dna fragmentation assays
基本上涵盖了细胞凋亡的各个期，对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。
线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为bvk250）和bd公司出售的盒apo-alert试剂盒。其检测主要采用阳离子型荧光染料。原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。可以在荧光显微镜下，或流式检测。采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。
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在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰*（ps）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。annexin－v是一种35－36 kd的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对ps具有较高的亲和力。细胞凋亡时，可以和外翻的ps结合，从而可以检测凋亡的细胞。发生死亡的细胞其细胞膜上的ps也外翻，因而也会阳性。因此，常用的凋亡试剂盒除了采用annexin－v标记之外，还会加一种dna染料，常用的有pi和7－aad，由于死亡的细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和dna结合，从而可以发荧光，区分出死细胞。
下图给出的是在使用fas单抗诱导前后的检测结果，横坐标是annexin-v fitc, 纵坐标是pi，左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细胞，左下象限是存活的细胞，右下象限是凋亡的细胞。
在采用annixin v方法检测凋亡细胞时，要特别强调一点：该方法适用于悬浮生长的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞，由于在*等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较高的假阳性，从而影响检测结果。尽管目前，包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。我不*用该方法检测。因为其重复性较差，且需要操作时非常小心。
dna周期检测原本是用来反应细胞各个期，即细胞增殖状况的。利用细胞内dna能够和荧光染料，如pi，结合的特性。细胞各个期由于其dna含量不同从而结合的荧光染料不同，流式检测的荧光轻度也不一样。g2－m期dna含量是g0－g1的两倍，而s期介与两者之间。
但是由于发现凋亡的细胞dna含量较少，因而可以在细胞g0－g1期前面有一个亚二倍体峰，从而认为是凋亡细胞。但是由于死亡的细胞本身其dna含量也是减少的，因而非常难于区分凋亡和死亡的细胞。在90年代，该方法曾经风靡一时，现在看来，那时的实验结果需要推敲。尽管，经典的流式检测资料给出的图是认为凋亡的细胞是紧挨着g0－g1期峰的一个峰，死亡的细胞峰离g0－g1期峰较远，但是这种典型的结果似乎很难获得。有其它的替代方法，*可以不用这种方法。
下图横轴代表pi的荧光强度，纵轴代表细胞数目，各个期根据荧光强度可以简单的进行区分。
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