GB/T 30955-2014 饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法
中华人民共和国国家标准
gb/t 30955-2014
饲料中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的测定
免疫亲和柱净化-高效液相色谱法
1范围
本标准规定了饲料中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的免疫亲和层析净化高效液相色谱法的测定方法。
本标准适用于饲料中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的测定。
本标准的检测限：黄曲霉毒素b1为0.2μg/kg，黄曲霉毒素b2为0.2μg/kg，黄曲霉毒素g1为0.3μg/kg，黄曲霉毒素g2为0.3μg/kg。
本标准的定量限：黄曲霉毒素b1为1.0μg/kg，黄曲霉毒素b2为1.0μg/kg，黄曲霉毒素g1为1.0μg/kg，黄曲霉毒素g2为1.0μg/kg。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不ke少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
gb/t 14699.1饲料采样
gb/t 20195动物饲料试样的制备
3原理
试样经过甲醇-水提取后，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析柱层析净化，经高效液相色谱仪分离，荧光检测器柱后光化学衍生测定黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的含量。
4试剂
除非另有说明，均为分析纯的试剂；实验室用水符合gb/t6682中二级用水规定，标准溶液和流动相用水符合一级用水规定。
4.1甲醇：色谱纯。
4.2 苯：色谱纯。
4.3乙腈：色谱纯。
4.4甲醇+水（8+2）：取80 ml甲醇（4.1）加20 ml水，混合均匀。
4.5甲醇+水（45+55）：取45 ml甲醇（4.1）加55 ml水，混合均匀。
4.6 苯+乙腈（98+2）：取2 ml乙腈（4.3）加入98 ml苯（4.2），混合均匀。
4.7黄曲霉毒素标准储备溶液：用苯+乙腈（98+2）溶液（4.6）分别配制0.100 mg/ml的黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2标准储备液，保存于4℃备用，可使用1年。
4.8黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取适量的黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2标准储备溶液（4.7），50℃下，氮气吹干仪吹干，用适量的甲醇+水（45+ 55）溶液（4.5）定容为混合标准工作液，黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2各分别为0 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ ml、50 ng/ml。
4.9 pbs缓冲溶液：称取8.0 g氯化钠，1.2 g磷酸氢二钠，0.2 g磷酸二氢钾，0.2 g氯化钾，用990 ml纯水溶解，然后用浓盐酸调节ph值至7.0，最后用纯水稀释至1000 ml。
4.10次氯酸钠。
5仪器和设备
实验室常规仪器、设备、材料及下列各项。
5.1高速均质器，18 000 r/ min~22 000 r/min，或震荡器。
5.2黄曲霉毒素免疫亲和柱，柱容量≥300 ng。
5.3玻璃纤维滤纸，直径11 cm，孔径1.5μm。
5.4玻璃定量管，10 ml。
5.5氮吹仪，50℃。
5.6光化学衍生系统。
5.7高效液相色谱仪，带荧光检测器。
6试样采集与制备
按gb/t 14699.1采样；按gb/t 20195用四分法缩减至500 g，粉碎后过1 mm孔径的分析筛，混匀后装入密闭容器，冷藏保存。
7分析步骤
7.1提取
称取试样（粒度小于1mm）50.0 g于250 ml具塞锥形瓶中，加入5.0 g氯化钠及准确加入100.0 ml（v1）甲醇+水（8+2）溶液（4.4），以均质器高速搅拌提取2 min，或震荡器震荡30 min。定量滤纸过滤，准确移取10.0 ml（v2）滤液并加入40.0 ml（v3）pbs缓冲溶液（4.9）稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1~2次，至滤液澄清，备用。
7.2净化
将免疫亲和柱连接于10.0 ml玻璃定量管下。准确移取10.0 ml（v，）样品提取液注入玻璃定量管中，将空气压力泵与玻璃定量管连接，调节压力使溶液以不超过2ml/min流速缓慢通过免疫亲和柱，待溶液全部流出后，以10.0 ml纯水清洗柱子2次，弃去全部流出液。准确加入1.0 ml（v）甲醇（4.1）洗脱，流速不超过1ml/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，加纯水定容为2.0ml，供色谱检测用。
7.3测定
7.3.1色谱条件
色谱柱：c18柱，长150 mm，内径4.6 mm，填料直径5μm，或相当者。
流动相：甲醇+水（45+ 55）溶液（4.5）。
流速：0.8 ml/min。
检测波长：激发波长360 nm；发射波长440 nm。
光化学衍生系统。
柱温：30℃。
进样量：20μl。
7.3.2色谱测定
分别取相同体积样液和标准工作溶液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积）。经过与黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2标准溶液谱图比较响应值得到试样中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的浓度c（μg/l）。标准品色谱图参见附录a。
警告——黄曲霉毒素是高致癌性物质，应十分小心处理。使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液用5%浓度次氯酸钠溶液浸泡过夜。
8结果计算与表述
8.1结果计算
试样中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2含量以质量分数xi计，单位为微克每千克（μg/kg），按式（1）计算：
式中：
pi——试样溶液中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2各组分的峰面积值；
vi——样品的总稀释体积，单位为毫升（ml）；
ci——黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2各标准溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
v——标准溶液的进样体积（μl）；
p——黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2各标准溶液峰面积平均值；
m——试样质量，单位为克（g）。
8.2结果表示
测定结果用平行测定的算术平均值表示，计算结果表示到小数点后一位。
9重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于其算术平均值的15%。
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gb/t 30955-2014
饲料中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的测定
免疫亲和柱净化-高效液相色谱法
1范围
本标准规定了饲料中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的免疫亲和层析净化高效液相色谱法的测定方法。
本标准适用于饲料中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的测定。
本标准的检测限：黄曲霉毒素b1为0.2μg/kg，黄曲霉毒素b2为0.2μg/kg，黄曲霉毒素g1为0.3μg/kg，黄曲霉毒素g2为0.3μg/kg。
本标准的定量限：黄曲霉毒素b1为1.0μg/kg，黄曲霉毒素b2为1.0μg/kg，黄曲霉毒素g1为1.0μg/kg，黄曲霉毒素g2为1.0μg/kg。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不ke少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
gb/t 14699.1饲料采样
gb/t 20195动物饲料试样的制备
3原理
试样经过甲醇-水提取后，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析柱层析净化，经高效液相色谱仪分离，荧光检测器柱后光化学衍生测定黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的含量。
4试剂
除非另有说明，均为分析纯的试剂；实验室用水符合gb/t6682中二级用水规定，标准溶液和流动相用水符合一级用水规定。
4.1甲醇：色谱纯。
4.2 苯：色谱纯。
4.3乙腈：色谱纯。
4.4甲醇+水（8+2）：取80 ml甲醇（4.1）加20 ml水，混合均匀。
4.5甲醇+水（45+55）：取45 ml甲醇（4.1）加55 ml水，混合均匀。
4.6 苯+乙腈（98+2）：取2 ml乙腈（4.3）加入98 ml苯（4.2），混合均匀。
4.7黄曲霉毒素标准储备溶液：用苯+乙腈（98+2）溶液（4.6）分别配制0.100 mg/ml的黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2标准储备液，保存于4℃备用，可使用1年。
4.8黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取适量的黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2标准储备溶液（4.7），50℃下，氮气吹干仪吹干，用适量的甲醇+水（45+ 55）溶液（4.5）定容为混合标准工作液，黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2各分别为0 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ ml、50 ng/ml。
4.9 pbs缓冲溶液：称取8.0 g氯化钠，1.2 g磷酸氢二钠，0.2 g磷酸二氢钾，0.2 g氯化钾，用990 ml纯水溶解，然后用浓盐酸调节ph值至7.0，最后用纯水稀释至1000 ml。
4.10次氯酸钠。
5仪器和设备
实验室常规仪器、设备、材料及下列各项。
5.1高速均质器，18 000 r/ min~22 000 r/min，或震荡器。
5.2黄曲霉毒素免疫亲和柱，柱容量≥300 ng。
5.3玻璃纤维滤纸，直径11 cm，孔径1.5μm。
5.4玻璃定量管，10 ml。
5.5氮吹仪，50℃。
5.6光化学衍生系统。
5.7高效液相色谱仪，带荧光检测器。
6试样采集与制备
按gb/t 14699.1采样；按gb/t 20195用四分法缩减至500 g，粉碎后过1 mm孔径的分析筛，混匀后装入密闭容器，冷藏保存。
7分析步骤
7.1提取
称取试样（粒度小于1mm）50.0 g于250 ml具塞锥形瓶中，加入5.0 g氯化钠及准确加入100.0 ml（v1）甲醇+水（8+2）溶液（4.4），以均质器高速搅拌提取2 min，或震荡器震荡30 min。定量滤纸过滤，准确移取10.0 ml（v2）滤液并加入40.0 ml（v3）pbs缓冲溶液（4.9）稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1~2次，至滤液澄清，备用。
7.2净化
将免疫亲和柱连接于10.0 ml玻璃定量管下。准确移取10.0 ml（v，）样品提取液注入玻璃定量管中，将空气压力泵与玻璃定量管连接，调节压力使溶液以不超过2ml/min流速缓慢通过免疫亲和柱，待溶液全部流出后，以10.0 ml纯水清洗柱子2次，弃去全部流出液。准确加入1.0 ml（v）甲醇（4.1）洗脱，流速不超过1ml/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，加纯水定容为2.0ml，供色谱检测用。
7.3测定
7.3.1色谱条件
色谱柱：c18柱，长150 mm，内径4.6 mm，填料直径5μm，或相当者。
流动相：甲醇+水（45+ 55）溶液（4.5）。
流速：0.8 ml/min。
检测波长：激发波长360 nm；发射波长440 nm。
光化学衍生系统。
柱温：30℃。
进样量：20μl。
7.3.2色谱测定
分别取相同体积样液和标准工作溶液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积）。经过与黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2标准溶液谱图比较响应值得到试样中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2的浓度c（μg/l）。标准品色谱图参见附录a。
警告——黄曲霉毒素是高致癌性物质，应十分小心处理。使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液用5%浓度次氯酸钠溶液浸泡过夜。
8结果计算与表述
8.1结果计算
试样中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2含量以质量分数xi计，单位为微克每千克（μg/kg），按式（1）计算：
式中：
pi——试样溶液中黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2各组分的峰面积值；
vi——样品的总稀释体积，单位为毫升（ml）；
ci——黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2各标准溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
v——标准溶液的进样体积（μl）；
p——黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2各标准溶液峰面积平均值；
m——试样质量，单位为克（g）。
8.2结果表示
测定结果用平行测定的算术平均值表示，计算结果表示到小数点后一位。
9重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于其算术平均值的15%。
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