漩涡振荡器在土壤微生物中提取总DNA并纯化应用
实验概要
从土壤微生物中提取总dna并纯化，高质量的dna可用于后续文库构建。
主要试剂
tenp缓冲液（50 mmol/l tris, 20 mmol/l edta, 100 mmol/l nacl, 1% pvp, ph 10.0）
pbs缓冲液（137 mmol/l nacl, 2.7 mmol/l kcl, 10 mmol/l na2hpo4, 2 mmol/l kh2po4, ph 7.4）
dna提取缓冲液（100 mmol/l tris, 100 mmol/l edta, 100 mmol/l na3po4, 1.5 m nacl, 1%ctab, ph 8.0）
蛋白酶k（25 mg/ml）
（50 mg/ml, ph 8. 0）
20% sds
氯仿
异戊醇
异丙醇
70%乙醇
rnase 20 mg/ml
qiaxⅱ大片段凝胶回收试剂盒（qiagen）
主要设备
50ml、1.5 ml离心管
摇床
高速离心机
水浴锅
电泳槽
电泳仪
mixmax漩涡振荡器
实验材料
土壤样品
实验步骤
1. 总dna提取：
（1） 取2 g土样，置于50ml灭菌的离心管中；
（2） 加入10 ml tenp缓冲液（50 mmol/l tris, 20 mmol/l edta, 100 mmol/l nacl, 1% pvp, ph 10.0）悬浮土样，200转摇床振荡10min充分混匀；
（3） 10 000 r/min离心5 min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本为无色；
（4） 用5 ml pbs缓冲液（137 mmol/l nacl, 2.7 mmol/l kcl, 10 mmol/l na2hpo4, 2 mmol/l kh2po4, ph 7.4）漂洗一次；
（5） 沉淀加入13.5 ml dna提取缓冲液（100 mmol/l tris, 100 mmol/l edta, 100 mmol/l na3po4, 1.5 m nacl, 1%ctab, ph 8.0），混匀后加入100 μl蛋白酶k（25 mg/ml）和200 μl（50 mg/ml, ph 8. 0），37℃水浴30 min，每隔10 min颠倒混匀；
（6） 加入2 ml 20% sds，65℃水浴2 h，每隔20 min颠倒混匀；
（7） 8 000 r/min室温离心15 min，取上清，用等体积氯仿:异戊醇（24:1）抽提一次；
（8） 水相中加入0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀一夜；
（9） 11 000 r/min 4℃离心20 min收集dna沉淀；
（10） 70%乙醇漂洗两次，干燥后用100 μl ddh2o（含rnase 20 mg/ml）溶解，转入1.5 ml离心管。
2. 总dna纯化：
（1） 配制0.8%琼脂糖凝胶；
（2） 每个上样孔加入50 μl粗dna，进行低电压长时间电泳（4℃, 25 v, 8 h）；
（3） 电泳结束后，切下主带所在的凝胶（胶的体积尽可能小）；
qiaxⅱ大片段凝胶回收试剂盒（qiagen）回收：加入3倍体积的buffer qxⅰ及适量的qiaxⅱ（glassmilk），55℃温浴10 min，每隔2 min轻轻用手指弹起沉淀（回收大片段时不要涡旋），待凝胶溶解，12 000 g离心1 min，弃上清；再加入500 μl buffer qxⅰ洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶；再用500 μl buffer pe洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适当体积的ddh2o，离心后收集上清，琼脂糖凝胶电泳确定回收效率。
关键词：高速离心机 水浴锅 电泳仪 振荡器
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1. 总dna提取：
（1） 取2 g土样，置于50ml灭菌的离心管中；
（2） 加入10 ml tenp缓冲液（50 mmol/l tris, 20 mmol/l edta, 100 mmol/l nacl, 1% pvp, ph 10.0）悬浮土样，200转摇床振荡10min充分混匀；
（3） 10 000 r/min离心5 min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本为无色；
（4） 用5 ml pbs缓冲液（137 mmol/l nacl, 2.7 mmol/l kcl, 10 mmol/l na2hpo4, 2 mmol/l kh2po4, ph 7.4）漂洗一次；
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（6） 加入2 ml 20% sds，65℃水浴2 h，每隔20 min颠倒混匀；
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（9） 11 000 r/min 4℃离心20 min收集dna沉淀；
（10） 70%乙醇漂洗两次，干燥后用100 μl ddh2o（含rnase 20 mg/ml）溶解，转入1.5 ml离心管。
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