PCR实验预准备事项
实时荧光定量pcr技术，是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。pcr实验是分子生物学中常见用的实验之一，在基因扩增、核酸检测、基因检测等方面广泛应用。pcr实验前的准备:在开始pcr实验之前，必须准备好dna模板（基因组dna或逆转录制备的cdna）、特异性引物（自己设计或用软件设计），并选择合适的商业酶（选择符合您实验目的的酶)
1、dna聚合酶。有许多商业dna聚合酶，它们具有不同的特性。一般分为两类：高保真聚合酶和普通taq聚合酶。如果您想对没有任何突变的特定dna片段进行pcr，请选择高保真聚合酶。如果只是想检测特定序列的存在，就选择普通的taq聚合酶。如果要对t-vector连接的片段进行pcr，要注意，因为大多数高保真聚合酶的产物都没有a-tailing，所以应该选择普通的taq聚合酶或在pcr实验后添加a-tailing。
2、引物的特异性影响pcr成功的概率，良好的引物设计对pcr扩增的成功至关重要。当您开始设计引物时，应仔细考虑以下几个原则：①引物的长度。pcr引物一般在18-22bp左右。这对于引物特异性和在退火温度下的结合来说是足够长的。②熔化温度(tm)。tm定义为在此温度下，dna双链体的一半将解离成单链dna。52-58c范围内的引物tm是最佳的。③gc含量。最佳gc含量应为40-60%。④许多软件可用于引物设计，例如primer5和oligo。这些软件推荐的引物通常可以满足我们的需求。
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