Fab抗体噬菌体展示流程
1. 什么是fab抗体
fab片段是抗体结构中可以与抗原结合的区域，也叫做抗原结合片段，涉及到抗体-抗原结合的亲和力，抗体特异性等特征。抗体fab片段含有1个可变区(v区)和1个恒定区（c1），v区含有3个互补决定结构域（cdr），涉及到ldiotypic antibody的产生，抗体的超频突变，尤其是cdr3结构域是抗体工程改造的核心区域；c1区主要起结构支撑作用。
图1：fab抗体示意图
2. fab抗体文库优点
重组fab的优势比较明显，由于不具备fc区，从而不需要翻译后修饰和糖基化，可以同时在原核和哺乳动物系统中表达。生产fab片段，通常利用大肠杆菌表达系统与哺乳动物表达系统。大肠杆菌表达系统具有生产成本低、生产速度快等优点，但容易形成包涵体，复性后活性难保证。
3. scfv抗体和fab抗体区别
表1：fab抗体与scfv抗体区别
4. fab抗体文库应用
fab类抗体片段具有分子质量小、组织分布特异性强、免疫原型低、可基因工程操作等特点，使fab成为了医药研究领域的重要成员之一，fab类药物在预防、诊断、治疗等领域有着广泛的应用，例如：已经上市的赛妥珠单抗酯（一种fab片段，cat：yr1612），可以有效地针对类风湿性关节炎；作为fab片段的美妥昔单抗i也已经用于治疗肺癌等。
5. 卡梅德生物能够为客户提供高质量的fab抗体噬菌体展示服务
卡梅德生物（kmd bioscience）多年来致力于抗体领域研究。我们积累了丰富的抗体文库构建经验，能够为客户提供基于抗体噬菌体展示文库技术的fab抗体文库构建服务。
6. 卡梅德生物为客户提供fab抗体文库构建服务的全流程介绍
卡梅德生物为客户提供fab噬菌体文库构建服务，流程包括：抗体cdna制备，基因扩增，载体构建，电击转化，抗体鉴定，fab文库包装。
图2：fab噬菌体展示抗体库构建流程
6.1 抗体cdna制备
6.1.1 外周血单核细胞单克隆化
客户提供人外周血淋巴细胞，淋巴结细胞或脾脏细胞（保存在rna later等溶液中，避免rna降解，蓝冰运输），ebv病毒单克隆化。
6.1.2 总rna提取
将外周血淋巴细胞从冰箱取出后分装，加入氯仿，离心后取上清加入异丙醇，离心保留沉淀，加入75%乙醇后离心保留沉淀，干燥后加入depc水，孵育确保rna溶解，将各管混合到一管中即为总rna，取总rna进行电泳，取 总rna 用核酸浓度测量仪测浓度。
6.1.3 反转录获取cdna
按照商业化试剂盒操作说明书进行cdna制备，将上一步得到的rna反转录成cdna。
6.2 基因扩增
以cdna为模板扩增抗体重链（fd段）和轻链可变区基因。
图3：fd和轻链pcr扩增结果
6.3载体构建
pcr 扩增的 fd 片段产物（通过琼脂糖凝胶电泳分离）用过量的限制酶切割，通常约350ng与2μg xho/spe i 线性化的 pcomb3 载体（通过分离琼脂糖凝胶电泳）在150μl 的总体积中与连接酶在 16℃下反应 15小时，命名为p+fd。pcr扩增的轻链片段产物和重组的p+fd（琼脂糖凝胶电泳分离）用过量的限制酶切割，连接、转化，将具有fd和κ轻链的噬菌粒命名为pcomb3h +κ+ fd。
6.4电击转化
6.4.1将连接产物进行电击转化后构建含有目的抗体片段的大肠杆菌文库
取大肠杆菌感受态细胞，加入回收后的连接产物，将混合后的感受态细胞和连接产物转移到预冷好的电转杯中，使用电转仪预设的转化程序电击转化，电转后立即往电转杯中加入培养基，至少进行20个电转。将细胞复苏后涂在琼脂糖培养板上过夜生长。将上一步过夜生长后的培养板上的细胞用培养基和涂布棒冲洗刮下，加入甘油测od600nm值后保存在-80℃，即为细菌文库。
6.4.2 fab噬菌体文库筛选
6 孔板（nunclon™）用等量的外周血淋巴细胞包被 5×106 个细胞，然后在4℃下用 bsa/pbs 封闭过夜。每孔加入 1 ml 噬菌体文库，37℃孵育 2 h。对于第 1、2、3、4 和 5 轮，分别用 tbs/ 吐温 20 (tbst) 洗涤未结合的噬菌体 1、5、10、10、10 次。通过添加洗脱缓冲液（0.1 m hcl，用固体甘氨酸调节至 ph 2.2 并含有 0.1% bsa）洗脱结合的噬菌体，并用 2 m tris 缓冲液，ph 8.0 中和洗脱溶液。如上所述遵循 vcsm13 辅助噬菌体的扩增程序，同时在 lb-氨苄青霉素平板上滴定输入和输出噬菌体。噬菌体结合、洗脱和扩增步骤进行5轮。
6.5抗体鉴定
随机挑选20-50个克隆，pcr鉴定阳性率，测序和分析抗体序列。
图4：阳性率:>90%
6.6 fab文库包装
交付＞1x1013噬菌体颗粒/ml。
传统的杂交瘤技术生产单克隆抗体成本高，而且产生的鼠源抗体往往具有触发人抗小鼠抗体（hama）反应的缺点。因此，通过噬菌体展示技术产生的重组 fab 抗体可以成为治疗肿瘤的合适替代方案。卡梅德生物为您提供的人源fab抗体文库构建服务亲和力高，库容量高，独立克隆数107-1012，根据客户需求制备，为每一个客户量身定制实验方案。
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图1：fab抗体示意图
2. fab抗体文库优点
重组fab的优势比较明显，由于不具备fc区，从而不需要翻译后修饰和糖基化，可以同时在原核和哺乳动物系统中表达。生产fab片段，通常利用大肠杆菌表达系统与哺乳动物表达系统。大肠杆菌表达系统具有生产成本低、生产速度快等优点，但容易形成包涵体，复性后活性难保证。
3. scfv抗体和fab抗体区别
表1：fab抗体与scfv抗体区别
4. fab抗体文库应用
fab类抗体片段具有分子质量小、组织分布特异性强、免疫原型低、可基因工程操作等特点，使fab成为了医药研究领域的重要成员之一，fab类药物在预防、诊断、治疗等领域有着广泛的应用，例如：已经上市的赛妥珠单抗酯（一种fab片段，cat：yr1612），可以有效地针对类风湿性关节炎；作为fab片段的美妥昔单抗i也已经用于治疗肺癌等。
5. 卡梅德生物能够为客户提供高质量的fab抗体噬菌体展示服务
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6.2 基因扩增
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图3：fd和轻链pcr扩增结果
6.3载体构建
pcr 扩增的 fd 片段产物（通过琼脂糖凝胶电泳分离）用过量的限制酶切割，通常约350ng与2μg xho/spe i 线性化的 pcomb3 载体（通过分离琼脂糖凝胶电泳）在150μl 的总体积中与连接酶在 16℃下反应 15小时，命名为p+fd。pcr扩增的轻链片段产物和重组的p+fd（琼脂糖凝胶电泳分离）用过量的限制酶切割，连接、转化，将具有fd和κ轻链的噬菌粒命名为pcomb3h +κ+ fd。
6.4电击转化
6.4.1将连接产物进行电击转化后构建含有目的抗体片段的大肠杆菌文库
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