滞留抑菌效果鉴定试验
1 原 理
本试验通过模拟适合细菌生长、繁殖和可能产生感染的皮肤条件下，使用随机性、双盲的、配对比较的方法，检测抗（抑）菌样品12h或24h的滞留抑菌效果。
2 实验器材
（1）试验产品 试验品为25套按顺序编号的样品。每套2块，一块为测试样品皂，另一块为不含抗（抑）菌剂的对照样品
（2）不含抑菌剂的洗发液和沐浴液各25瓶（200ml/瓶，试验调整阶段用）
（3）不含抑菌剂的香皂 25块（试验调整阶段用）
（4）*大豆肉汤培养基（tsb）
（5）*大豆琼脂培养基（tsa）
（6）0.075mol/l的磷酸盐缓冲液
（7）70%酒精
（8）恒温培养箱
（9）金属筒 （直径2.2cm、高度3cm）
（10）一次性接种环（直径4mm）
（11）小塑料碗（直径2.2cm、高2.5mm）
（12）胶带（darapore，3m公司生产）
（13）尼龙刮菌棒
（14）triton-x 100 500ml
（15）外用抗生素软膏（例如：百多邦*软膏）
（16）玻璃弯棒
（17）羊血 经脱纤维处理
（18）*atcc 27217（此株*是一种低毒性、对*敏感、对四环素有抗药性的色素株，曾用于许多试验研究，没有任何严重副作用）。
（19）皮肤消毒剂
3 试验步骤
（1）调整阶段
试验开始前 7d至 14d， 志愿者使用不含抗（抑）菌成分的香皂、洗发水和沐浴液进行日常的洗手、洗澡。此阶段持续至少 7d，但不超过 14d。
（2）清洗阶段
清洗阶段共 3d，志愿者每天用抗（抑）菌样品清洗一侧前臂， 用对照样品清洗另一侧前臂，清洗过程如下：
1）先清洗左臂，用流动水（水温应保持在 35℃～37℃）打湿前臂内侧；
2） 用香皂从手腕至臂肘上下摩擦15s；
3）用手在涂有香皂的手臂上上下摩擦泡沫45s；
4）用流动的清水冲洗前臂15s， 不要搓擦；
5）用纸巾沾干前臂. 不要搓擦；
6）重复以上步骤清洗右臂；
7）按上面所描述的试验步骤每日清洗前臂3次，每次间隔至少一个小时，在zui后一次清洗之后，需记录好时间，在 12h之后，进行滞留效果检测。在第9次清洗前臂以后，志愿者不能洗澡、淋浴或洗净前臂，直到试验结束。清洗前后的两块香皂的重量及志愿者完成清洗的情况，须记录下来。
（3）试验阶段
清洗阶段的第四天（zui后一次清洗后 12h或24h），将在志愿者每只前臂上划出一个试验区，对试验区进行接种、封包和回收存活细菌，具体步骤如下:
1）将*（atcc 27217）连续转种3代，取第3代培养物接种于胰蛋白大豆肉汤培养基（tsb）中，在 35℃±2℃ 的条件下培养 20h ±2h。然后用*大豆肉汤适当稀释菌悬液，使菌悬液浓度约为 108cfu/ml～109cfu/ml。
2）细菌接种：在志愿者的每只前臂中间部位（不要在手腕和肘皱褶处），用带有印墨直径为3.00cm的玻璃量筒扣在皮肤上，划分出一个试验区。使用加样器取10μl上述菌悬液，接种于前臂试验区（菌落数为106cfu/试验区～107cfu/试验区），用一次性接种环，把接种物涂成一圆形，使其与试验区边缘应有 4mm～5mm的距离。
3）封包：细菌接种后立即用小塑料碗扣于染菌区上面 ，再用胶带将小塑料碗固定在皮肤上，记录封包的时间。
4）回收存活细菌：接种后 2h±5min 对前臂上接种的区域进行取样。将金属筒放置于试验区中间部位，不要接触到盖有印墨的边缘。将 1ml 含0.1% triton-x100的0.075mol/l磷酸盐缓冲液吸移至金属筒内，用尼龙刮菌棒刮洗金属筒罩住区域内的皮肤 60s，将筒内液体吸移至试管内，再加 1ml 含0.1%triton x-100的 0.075mol/l磷酸盐缓冲液，对该区域内的皮肤进行第二次刮洗 30s，将第二次擦洗的液体，注入含*次刮洗液体的试管中。
5）实验区试验后的消毒处理: 一个实验区采样之后，需用70% 的酒精对实验区进行消毒。然后对另一个实验区以同样方法进行采样， 采样结束后，先用70% 的酒精对实验区进行消毒，然后用皮肤消毒剂对两只前臂进行消毒处理，处理后清水冲洗，擦干，再涂少量的抗生素软膏。
6）平皿接种与培养:对每一个取样进行平皿接种，以 0.0375mol/l磷酸盐缓冲液对样品进行10倍系列稀释，选适当稀释度取 0.1ml 接种于2个含5% 羊血的tsa平板表面，用玻璃弯棒涂匀，在 35℃±2℃ 的培养箱中培养 48h±4h，计数菌落数。
7）以试验同批次的稀释液、培养基等分别设阴性对照。 8）抑菌率的计算
抑菌率=[ （对照平均菌落数－试验平均菌落数）/ 对照平均菌落数] ×100%
4评价规定
（1）各次试验阴性对照菌无菌生长。
（2）实验不得少于16人次，抑菌率均≥ 50%，判定该产品在规定的时间内有滞留抑菌作用。
5 注意事项
（1）志愿者录用标准
1）年龄介于18岁至65岁的男性或女性；
2）志愿者应身体健康；
3）前臂应完好无损且没有皮肤病及其它皮肤问题；
4）同意在整个试验期间，避免使用抗（抑）菌洗液和乳膏、局部类固醇类药和全身或局部使用抗生素，除非因为并发病症医生要求使用；
5）同意在清洗阶段使用非药物香皂或洗液洗澡和淋浴，但志愿者不能清洗前臂。在第9次洗完前臂以后，不洗澡，淋浴或洗净前臂，直到试验结束。
（2）排除志愿者的标准 如果志愿者有下列情况之一，不能被录用参加试验
1）同时参加另外一个临床试验
2）在过去的 14d中，参加过任何一种形式的关于清洁手或手臂的试验
3）对香皂、去污剂、香水或*过敏
4）怀孕妇女
5）诊断患有糖尿病、肝炎、艾滋病（hiv阳性）等
（3）其它试验限制
1）志愿者不得使用其它清洁用品；
2）志愿者应避免洗热水盆浴和游泳；
3）志愿者应避免接触未干的油漆、涂料或者其它溶剂；
4）志愿者应避免在手腕处和前臂上喷洒香水。
（4）在试验完成后的 48h～72h内，需检查前臂上有无小脓疱、水疱，隆起的红色痒疱。出现这些情况的志愿者应尽快通知检验单位。
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（2）不含抑菌剂的洗发液和沐浴液各25瓶（200ml/瓶，试验调整阶段用）
（3）不含抑菌剂的香皂 25块（试验调整阶段用）
（4）*大豆肉汤培养基（tsb）
（5）*大豆琼脂培养基（tsa）
（6）0.075mol/l的磷酸盐缓冲液
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（9）金属筒 （直径2.2cm、高度3cm）
（10）一次性接种环（直径4mm）
（11）小塑料碗（直径2.2cm、高2.5mm）
（12）胶带（darapore，3m公司生产）
（13）尼龙刮菌棒
（14）triton-x 100 500ml
（15）外用抗生素软膏（例如：百多邦*软膏）
（16）玻璃弯棒
（17）羊血 经脱纤维处理
（18）*atcc 27217（此株*是一种低毒性、对*敏感、对四环素有抗药性的色素株，曾用于许多试验研究，没有任何严重副作用）。
（19）皮肤消毒剂
3 试验步骤
（1）调整阶段
试验开始前 7d至 14d， 志愿者使用不含抗（抑）菌成分的香皂、洗发水和沐浴液进行日常的洗手、洗澡。此阶段持续至少 7d，但不超过 14d。
（2）清洗阶段
清洗阶段共 3d，志愿者每天用抗（抑）菌样品清洗一侧前臂， 用对照样品清洗另一侧前臂，清洗过程如下：
1）先清洗左臂，用流动水（水温应保持在 35℃～37℃）打湿前臂内侧；
2） 用香皂从手腕至臂肘上下摩擦15s；
3）用手在涂有香皂的手臂上上下摩擦泡沫45s；
4）用流动的清水冲洗前臂15s， 不要搓擦；
5）用纸巾沾干前臂. 不要搓擦；
6）重复以上步骤清洗右臂；
7）按上面所描述的试验步骤每日清洗前臂3次，每次间隔至少一个小时，在zui后一次清洗之后，需记录好时间，在 12h之后，进行滞留效果检测。在第9次清洗前臂以后，志愿者不能洗澡、淋浴或洗净前臂，直到试验结束。清洗前后的两块香皂的重量及志愿者完成清洗的情况，须记录下来。
（3）试验阶段
清洗阶段的第四天（zui后一次清洗后 12h或24h），将在志愿者每只前臂上划出一个试验区，对试验区进行接种、封包和回收存活细菌，具体步骤如下:
1）将*（atcc 27217）连续转种3代，取第3代培养物接种于胰蛋白大豆肉汤培养基（tsb）中，在 35℃±2℃ 的条件下培养 20h ±2h。然后用*大豆肉汤适当稀释菌悬液，使菌悬液浓度约为 108cfu/ml～109cfu/ml。
2）细菌接种：在志愿者的每只前臂中间部位（不要在手腕和肘皱褶处），用带有印墨直径为3.00cm的玻璃量筒扣在皮肤上，划分出一个试验区。使用加样器取10μl上述菌悬液，接种于前臂试验区（菌落数为106cfu/试验区～107cfu/试验区），用一次性接种环，把接种物涂成一圆形，使其与试验区边缘应有 4mm～5mm的距离。
3）封包：细菌接种后立即用小塑料碗扣于染菌区上面 ，再用胶带将小塑料碗固定在皮肤上，记录封包的时间。
4）回收存活细菌：接种后 2h±5min 对前臂上接种的区域进行取样。将金属筒放置于试验区中间部位，不要接触到盖有印墨的边缘。将 1ml 含0.1% triton-x100的0.075mol/l磷酸盐缓冲液吸移至金属筒内，用尼龙刮菌棒刮洗金属筒罩住区域内的皮肤 60s，将筒内液体吸移至试管内，再加 1ml 含0.1%triton x-100的 0.075mol/l磷酸盐缓冲液，对该区域内的皮肤进行第二次刮洗 30s，将第二次擦洗的液体，注入含*次刮洗液体的试管中。
5）实验区试验后的消毒处理: 一个实验区采样之后，需用70% 的酒精对实验区进行消毒。然后对另一个实验区以同样方法进行采样， 采样结束后，先用70% 的酒精对实验区进行消毒，然后用皮肤消毒剂对两只前臂进行消毒处理，处理后清水冲洗，擦干，再涂少量的抗生素软膏。
6）平皿接种与培养:对每一个取样进行平皿接种，以 0.0375mol/l磷酸盐缓冲液对样品进行10倍系列稀释，选适当稀释度取 0.1ml 接种于2个含5% 羊血的tsa平板表面，用玻璃弯棒涂匀，在 35℃±2℃ 的培养箱中培养 48h±4h，计数菌落数。
7）以试验同批次的稀释液、培养基等分别设阴性对照。 8）抑菌率的计算
抑菌率=[ （对照平均菌落数－试验平均菌落数）/ 对照平均菌落数] ×100%
4评价规定
（1）各次试验阴性对照菌无菌生长。
（2）实验不得少于16人次，抑菌率均≥ 50%，判定该产品在规定的时间内有滞留抑菌作用。
5 注意事项
（1）志愿者录用标准
1）年龄介于18岁至65岁的男性或女性；
2）志愿者应身体健康；
3）前臂应完好无损且没有皮肤病及其它皮肤问题；
4）同意在整个试验期间，避免使用抗（抑）菌洗液和乳膏、局部类固醇类药和全身或局部使用抗生素，除非因为并发病症医生要求使用；
5）同意在清洗阶段使用非药物香皂或洗液洗澡和淋浴，但志愿者不能清洗前臂。在第9次洗完前臂以后，不洗澡，淋浴或洗净前臂，直到试验结束。
（2）排除志愿者的标准 如果志愿者有下列情况之一，不能被录用参加试验
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3）对香皂、去污剂、香水或*过敏
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（3）其它试验限制
1）志愿者不得使用其它清洁用品；
2）志愿者应避免洗热水盆浴和游泳；
3）志愿者应避免接触未干的油漆、涂料或者其它溶剂；
4）志愿者应避免在手腕处和前臂上喷洒香水。
（4）在试验完成后的 48h～72h内，需检查前臂上有无小脓疱、水疱，隆起的红色痒疱。出现这些情况的志愿者应尽快通知检验单位。
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