简单的质粒DNA提取实验
在我们的细胞实验中经常会用到质粒dna，现在都用剂盒非常方便，而且菌体培养后，可以多管浓缩提取，提到的质粒量多，可以-20℃保存，以后用于酶切、转化等实验，可以提前跑个胶，只要不降解，就可以继续用，避免每次要用，都要培养一遍再提取一遍。
质粒dna的提取
质粒多为一些双链、环状的dna分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时max主要的dna载体。
实验步骤
1.摇菌培养
1）将鉴定测序正确的克隆菌液涂在lb固体平板。
2）置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。
3） 灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的lb液体培养基，编号标记。
4） 挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。
5） 37℃，180rpm，振荡培养过夜。
2.收获细菌并裂解
1） 离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入1.5ml离心管中。
2）用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。
3） 细菌高速离心1min,*去除上清。
4）加入250ulrb溶液，振荡器充分悬浮细菌。
5）加入250ullb溶液。立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。
6）加入250ulnb溶液。立即上下颠倒10次，使之充分中和，室温，放置2min。
7）室温，1500rpm，高速离心15min。
8）将吸附柱放入收集管内，离心得到的上清转移至吸附柱，室温，15000rpm，高速离心30s。
9）弃废液，将吸附柱放入收集管，加入700ul wb溶液到吸附柱中，15000rpm，高速离心30s。
10）重复上一操作。
11）将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中，加30-50ul预热的elution buffer，室温，放置2min，高速离心1min。
12）样品进行电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为2ul，紫外灯下观察，max明亮的带为超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。
3.质粒的纯化
1）将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中，加入1/10体积的3mol/l 无菌乙酸钠溶液。
2）加入2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。
3）4℃，高速离心机14000rpm，离心20min.
4）弃去上清，70%乙醇洗2次。
5）空气干燥，可置超净工作台干燥。
6）加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀，即为质粒溶液。
7）紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。
测量od260和od280的值：质粒dna浓度=od260×50×稀释倍数（μg/ml）。
10个常见问题
一.时间控制问题
裂解时间太长，加入溶液p2后裂解时间不应超过5 分钟；吸附时间不够；溶解时间不够都会导致质粒dna提取实验失败。
二.大肠杆菌老化
建议涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
三.质粒拷贝数低
由于使用低拷贝数载体引起的质粒dna 提取量低，可更换具体相同功能的高拷贝数载体。
四.溶液使用不当
溶液p2、p3 在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃培养箱保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
五.吸附柱过载
不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如tb 或者 ×yt 菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整lb 培养液体积。
六.质粒未全部溶解
洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
七.乙醇残留
漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。
八.洗脱液加入位置不正确
洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会*覆盖硅胶膜的表面达到max大洗脱效率。
九.洗脱液不合适
dna 只在低盐溶液中才能被洗脱。洗脱效率取决于ph 值。max大洗脱效率在ph7.0～ 8.5 间。当用水洗脱时确保其 ph 值在此范围内，如果ph 过低可能性导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加暖至 60 ℃后使用有利于提高洗脱效率。
十.洗脱体积太小
洗脱体积对来回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
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有关铸造特点及应用
数控转台会产生短路状况的缘由
峰值保留数显扭力矩扳手 1-300N.m数字显示扭力扳手 低功耗
PARKER径向柱塞泵使用技术操作原理
质粒dna的提取
质粒多为一些双链、环状的dna分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时max主要的dna载体。
实验步骤
1.摇菌培养
1）将鉴定测序正确的克隆菌液涂在lb固体平板。
2）置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。
3） 灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的lb液体培养基，编号标记。
4） 挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。
5） 37℃，180rpm，振荡培养过夜。
2.收获细菌并裂解
1） 离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入1.5ml离心管中。
2）用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。
3） 细菌高速离心1min,*去除上清。
4）加入250ulrb溶液，振荡器充分悬浮细菌。
5）加入250ullb溶液。立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。
6）加入250ulnb溶液。立即上下颠倒10次，使之充分中和，室温，放置2min。
7）室温，1500rpm，高速离心15min。
8）将吸附柱放入收集管内，离心得到的上清转移至吸附柱，室温，15000rpm，高速离心30s。
9）弃废液，将吸附柱放入收集管，加入700ul wb溶液到吸附柱中，15000rpm，高速离心30s。
10）重复上一操作。
11）将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中，加30-50ul预热的elution buffer，室温，放置2min，高速离心1min。
12）样品进行电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为2ul，紫外灯下观察，max明亮的带为超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。
3.质粒的纯化
1）将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中，加入1/10体积的3mol/l 无菌乙酸钠溶液。
2）加入2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。
3）4℃，高速离心机14000rpm，离心20min.
4）弃去上清，70%乙醇洗2次。
5）空气干燥，可置超净工作台干燥。
6）加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀，即为质粒溶液。
7）紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。
测量od260和od280的值：质粒dna浓度=od260×50×稀释倍数（μg/ml）。
10个常见问题
一.时间控制问题
裂解时间太长，加入溶液p2后裂解时间不应超过5 分钟；吸附时间不够；溶解时间不够都会导致质粒dna提取实验失败。
二.大肠杆菌老化
建议涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
三.质粒拷贝数低
由于使用低拷贝数载体引起的质粒dna 提取量低，可更换具体相同功能的高拷贝数载体。
四.溶液使用不当
溶液p2、p3 在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃培养箱保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
五.吸附柱过载
不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如tb 或者 ×yt 菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整lb 培养液体积。
六.质粒未全部溶解
洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
七.乙醇残留
漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。
八.洗脱液加入位置不正确
洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会*覆盖硅胶膜的表面达到max大洗脱效率。
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