艾伟拓AVT上新啦C12-200：如何从126种组合中脱颖而出
好消息一：
c12-200有效递送sirna[1]，通过组合筛选，可实现低剂量，高效率的基因沉默效果。
好消息二：
avt的c12-200已上线，欢迎询价采购。
在发现和开发能够引导小干扰rna(sirna)通过许多屏障保护目标细胞内部的载体方面，人们做出了巨大的努力。虽然研究已经显示基因沉默在体内的潜力，但要发挥rna干扰疗法的zui广泛潜力，必须提高给药效果。通过组合，合成和筛选不同类别的材料，已经确定了一种能使sirna引导的小鼠肝脏基因沉默的配方，其剂量低于0.01毫克/千克。这种制剂在一次注射后还能同时抑制五个肝基因的表达。这种制剂的潜力在非人类灵长类动物中得到进一步验证，在这种情况下，在低至0.03mg/kg的剂量下，观察到临床相关基因转胸腺肽的高度敲除水平。据文章所示，这种制剂有助于基因沉默，其剂量比任何先前描述的sirna肝传递系统所要求的低一个数量级。
lipidoid-sirna制备lipidoid-sirna制剂的体内筛选是由类脂，胆固醇，和peg脂质组成。在100、20和100 mg/ml的无水乙醇中分别溶解得到了类脂、胆固醇和dmg-mpeg 2000的原液。各组分按照比例组合，质量比为52：20：28。在200 mm的醋酸钠缓冲液(ph 5.0)中加入有机相，搅拌形成空脂质体。在50 mm的醋酸钠溶液中加入10 mg/ml的sirna，以总脂质：sirna为10：1的比例，将sirna加入空脂质体中，在37 ℃下孵育30 min。然后用3,500 mwco的透析盒(皮尔斯)对pbs进行透析75 min。在缓冲液交换后，每种制剂的样品被用于粒子的表征。采用改良的ribogreen法(invitrogen)定量sirna的包封率，用动态光散射法测量平均粒径。
用jeffs等人提出的方法制备了c12-200-sirna。用90%乙醇(摩尔比50：10：38.5：1.5)对c12-200、dspc、胆固醇和mpeg 2000-dmg进行增溶。sirna在10 mm柠檬酸盐溶液中溶解（ph3.0，缓冲液浓度为0.4mg/ml）。用装有双相泵头的蠕动泵，在等效体积流量下，混合在“t”结中，对乙醇脂质溶液和sirna水溶液进行了泵提。脂质与sirna的结合比例为7：1(wt:wt)。用pbs(155 mm nacl，3mm na2hpo4，1mm kh2po4，ph7.5)对自发形成的c12-200-sirna进行透析，去除乙醇和交换缓冲液。
组合设计
图1：通过组合，设计了阳离子脂质化合物库。
基于脂质的载体介导的sirna体外释放。
以荧光素酶表达的hela衍生细胞株为研究对象，以高通量的方式筛选脂质类材料。对这些细胞进行基因修饰，稳定表达酶。在本实验中，以质量比2.5：1，5：1，10：1和15：1的脂质：sirna进行络合，并与细胞在生长培养基中孵育。荧光素酶的表达在不发生肾素还原的情况下被认为是sirna介导的沉默，而renilla的表达被作为脂质相关毒性的内部对照。细胞毒性试验也没有任何不良反应的证据。在这个筛选中，发现了许多有助于荧光素酶沉默的化合物，其中三个化合物的沉默率超过90%。为了便于展示，只显示了5：1的质量比的数据。有趣的是，从这些结果中出现了许多结构-活动关系。就尾部长度而言，在15种性能好的结构中，有7种结构的尾长为14碳。此外，尾巴长度小于12-碳的化合物也不会引起大于30%的沉默。在头部基团设计中，amine113存在于前两种化合物和前15种化合物中的三种。虽然在c14尾和amine113上的趋同是明显的，但并不是所有含有这些结构的化合物都表现出沉默活性。例如，在体外，c8-113和c14-116都不能促进基因沉默，这表明通过优化胺基和尾长的组合来提高传递效率是必要的。
图2：脂质体库的体外筛选
在表达荧光素酶的hela细胞中，对脂质体进行筛选。（a）将抗荧光素酶的sirna与可电离阳离子脂质复合，与培养基中的细胞共同孵育。（b）小剂量sirna沉默荧光素酶。
图3：在小鼠体内沉默fvii因子。
图4：通过检测fvii蛋白水平，观察c12-200介导的基因沉默在体内持续时间超过40天。
图5：五个位于肝脏的基因靶点。
据我们所知，这是关于sirna介导的五个肝脏靶点在体内同时沉默的最早报道。考虑到c12-200介导的递送的效力，我们假设更多的基因可以同时被合并的sirna产物沉默。从治疗的角度来看，这可以实现更复杂的治疗方法，其中多个靶点的沉默可以获得增强的治疗效果。例如，这种策略可能特别适用于治疗病毒感染，如丙型肝炎病毒（hcv），在这种病毒感染中，快速进化的病毒基因组已被证明对单一序列的sirna难以实现。事实上，这一想法以前已经在体外证明，利用核糖核酸内切酶制备的sirna和编码针对hcv基因组多个区域的短发夹rna的逆转录病毒载体进行递送。这种多靶点治疗方法还可以采用不同的策略来治疗多因素疾病，如代谢综合征、癌症或感染性疾病
图6:c12-200-sirna颗粒通过大细胞吞噬引起细胞摄取
（a） 用c12-200配制的荧光标记的sirna与hela细胞在各种内吞途径的标记标记物存在下孵育。含有sirna的颗粒与标记的葡聚糖共定位，葡聚糖是一种已知通过大细胞吞噬作用进入细胞的液相标记物（白色箭头）。（b） 肌动蛋白纤维的荧光标记揭示了在hela细胞暴露于c12-200-sirna颗粒的15分钟内，膜褶皱（白色箭头）和肌动蛋白重排，这是大胞饮摄取的标志性指标。（c，d）细胞先前暴露于eipa和cytochalasin d，分别是大胞饮和肌动蛋白聚合的抑制剂，以剂量依赖性的方式减少c12-200-sirna颗粒的摄取。（s.d.，n=3，***p<0.005；**p<0.01；*p<0.05
图7:c12-200对非人类灵长类动物的治疗效果。
食蟹猴（每组n=3）通过头静脉接受pbs或0.03、0.1或0.3 mg/kg在c12-200中配制的sittr，作为15分钟的静脉输注（5 ml/kg）。在给药后48小时从动物身上采集肝活检。在肝脏样品中测定ttr mrna水平相对于gapdh mrna水平。数据点代表组平均值±s.d
本研究最终认为：开发安全有效的sirna递送载体是基于rnai的治疗方法持续进步的重要组成部分。随着c12-200等高效材料的鉴定，可以实现更宽的治疗指数、持久的基因沉默和多靶点治疗疾病的方法。
reference：
[1].lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing
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组合设计
图1：通过组合，设计了阳离子脂质化合物库。
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