遇到酶切不动或切不完的处理办法
遇到这种问题常常需要了解酶活性单位是如何确定，我们多次接到这样的问题：1个单位的酶能在60分钟内切1ug的dna,为什么我们的dna那么少切那么长时间也不能切开或切wan完quan？ 从下面几个因素去考虑：
1) 酶是否有活性：酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug lambda dna或特定线状dna所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用您待切的dna模板，也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的，虽然识别位点相同，但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式，通常需要用lambda dan做模板来判定。同时如果酶对甲基化敏感，还需要用dcm-, dam-的dna.不排除由于运输或分装不当导致酶活性下降，这种情况是很少发生。远慕销售的酶，在分装前严格检验过，不合格的东西（很少）都退回原厂，所以不合格的产品是不会送到用户手头的。
2) 模板性质是否清楚：如果 dna的类型变了所需要的酶量也不同。酶切效果与dna的性质（线状，超螺旋状）、位点数目、位点左右的序列、甲基化程度、纯度等有很大的关系。对超螺旋状dna完quan全酶切所需要的酶量要比线状的高好几倍(在我们的目录上有部分酶是有标注的)，同时需要提高酶的用量（10u/ug）和延长反应时间等措施。还有一个问题是有些时候dna是从别人那里得到的，背景不清楚也造成困惑。
3) 模板纯度是否够：模板制备方式影响dna的质量，制备过程中使用到乙醇，氯仿，ben酚，sds, edta等如果残留在最终的dna模板中，都会不同程度影响酶的活性。miniprep时如果用试剂盒抽提，需要的问题污染是变性剂和乙醇；如果是手工制备的，氯仿，乙醇，ben酚及细胞内其他杂质都会不同程度的干扰酶活性。
4) 甲基化程度对酶的活性是否有影响：细菌中主要有dcm和dam两种甲基化方式，在植物和动物细胞中主要是cg位被甲基化。仔细看看使用的酶对甲基化的敏感情况，或许能找到酶切效率低或根本不能酶切的根源。
5) 反应条件是否合适：对照说明书，检查使用的温度是否正确，是否需要添加bsa, 是否使用正确的缓冲溶液。由于缓冲液中基本都含有dtt,反复冻融会使模板使dtt降解。注意有些研究人员将buffer长时间放在4度或室温，这是很不规范的行为。
6) 酶稀释和添加方式是否正确：一般要求在最后加酶，但是对同时做多个相同反应的时候，最后加酶有可能不很方便。通常是将缓冲、酶和适量的水配制成一个混合物，然后分装，最后加模板。需要提醒的是混合物（master mix）中由于没有底物的存在，离子强度也不对，酶可能要受到损伤。这种提前混合的做法没有问题，只是动作要快一些，没有分装前的mix，要求放在冰里，尽快使用。
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2) 模板性质是否清楚：如果 dna的类型变了所需要的酶量也不同。酶切效果与dna的性质（线状，超螺旋状）、位点数目、位点左右的序列、甲基化程度、纯度等有很大的关系。对超螺旋状dna完quan全酶切所需要的酶量要比线状的高好几倍(在我们的目录上有部分酶是有标注的)，同时需要提高酶的用量（10u/ug）和延长反应时间等措施。还有一个问题是有些时候dna是从别人那里得到的，背景不清楚也造成困惑。
3) 模板纯度是否够：模板制备方式影响dna的质量，制备过程中使用到乙醇，氯仿，ben酚，sds, edta等如果残留在最终的dna模板中，都会不同程度影响酶的活性。miniprep时如果用试剂盒抽提，需要的问题污染是变性剂和乙醇；如果是手工制备的，氯仿，乙醇，ben酚及细胞内其他杂质都会不同程度的干扰酶活性。
4) 甲基化程度对酶的活性是否有影响：细菌中主要有dcm和dam两种甲基化方式，在植物和动物细胞中主要是cg位被甲基化。仔细看看使用的酶对甲基化的敏感情况，或许能找到酶切效率低或根本不能酶切的根源。
5) 反应条件是否合适：对照说明书，检查使用的温度是否正确，是否需要添加bsa, 是否使用正确的缓冲溶液。由于缓冲液中基本都含有dtt,反复冻融会使模板使dtt降解。注意有些研究人员将buffer长时间放在4度或室温，这是很不规范的行为。
6) 酶稀释和添加方式是否正确：一般要求在最后加酶，但是对同时做多个相同反应的时候，最后加酶有可能不很方便。通常是将缓冲、酶和适量的水配制成一个混合物，然后分装，最后加模板。需要提醒的是混合物（master mix）中由于没有底物的存在，离子强度也不对，酶可能要受到损伤。这种提前混合的做法没有问题，只是动作要快一些，没有分装前的mix，要求放在冰里，尽快使用。
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