抗（抑）菌效果贴膜试验
1 原 理
本方法是通过将细菌污染于抗菌制品表面，然后用塑料薄膜覆盖，使细菌与抗菌制品表面充分接触，以测定其抗菌效果。适用于抗菌塑料、抗菌地板、抗菌瓷砖等产品的抗（抑）菌效果测定。
2 实验器材
（1）实验菌株 *（atcc 6538）、大肠杆菌（8099）、白色念珠菌（atcc 10231），也可根据抑菌剂特定用途选用其他菌株
（2）磷酸盐缓冲液
（3）培养基 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（tsa）胰蛋白胨大豆肉汤培养基（tsb）与沙堡琼脂培养基
（4）薄膜 不影响细菌生长和不吸水的材料，厚度不规定，使用一面应有较好的粘合性，面积为 40mm±2mm的正方形
（5）无菌塑料袋
（6）恒温水浴箱
（7）37℃恒温培养箱
（8）样片 将试样及对照试样（与试样同质不含抗菌组分）分别制成边长为 50mm±2mm的正方形，其中抗菌样片3个，对照样片6个。试验前，以脱脂棉蘸取酒精轻轻擦拭样片 2～3次，充分干燥
3 操作程序
（1）倾注琼脂培养基平板。
（2）将菌悬液用1/500的营养肉汤稀释成2.5×105cfu/ml～1.0×106cfu/ml实验用菌悬液。
（3）将样片试验面朝上放于无菌平皿中，取 0.4ml 菌悬液滴染于样片*，涂匀。按图表示的方法用薄膜覆盖，小心触压薄膜，使菌液均匀散开，盖上平皿盖。如图2-3
（4）将装有接种过菌液的试验样片的平皿（3个抗菌样片和3个对照样片），置35℃±１℃，相对湿度不低于 90% 的条件下，培养箱内培养24ｈ±１ｈ。
（5）洗脱 以无菌操作方式用镊子将覆盖膜和试验样片放入塑料袋中，然后加入10ml 肉汤培养液，用手充分揉搓袋中的试验样片和覆盖薄膜，将细菌洗下。
（6）吸取 1ml 洗下的菌液，至含 9ml pbs的试管中，做系列10倍稀释，取适当稀释度接种２个平皿，以倾注法加入 15ml～20ml tsa，置 35℃±１℃恒温培养箱内培养 40h～48h。
（7）将另 3 个对照样片接种后立即用镊子将覆盖膜和试验样片放入塑料袋中，洗脱和接种方法与试验样片相同。
（8）以试验用同批次稀释液、培养基等分别设阴性对照。
（9）试验重复3次。
4 活菌数的计算
ｎ＝ｃ×ｄ×ｖ
ｎ：为活菌数
ｃ：为2个平板的平均菌落数
ｄ：为稀释倍数
ｖ：为洗脱用肉汤培养基的液体的毫升数
5 结果的计算与判定
（1）试验成立应符合的条件
1）各次试验阴性对照均无菌生长
2）对照样片接种后直接求出活菌数的对数值符合下列公式
（lzui大值 - lzui小值）/l平均值≤0.2
公式中，lzui大值 zui大活菌数的对数值
lzui小值 zui小活菌数的对数值
l平均值 平均活菌数的对数值
3）对照样片接种后的活菌数平均值应为 1.0×105cfu/样片～4.00×105cfu/样片
4）覆盖了薄膜的对照样片培养 24h后的活菌数，每样片均不少于 1.0×104cfu。
（2）抗菌活性值的计算：
r=log（b/a）-log（c/a）=log（b/c）
r: 抗菌活性值
a: 对照样片在接种后的活菌数的平均值
b：对照样片在接种后培养24h的活菌数的平均值
c：抗菌样片在接种后培养24h的活菌数的平均值
（3）评价规定
各次试验抗菌活性值均≥2.0，判定该试样具有抗菌作用。
6 注意事项
（1）用薄膜覆盖，小心触压薄膜，以免菌液溢出薄膜外。
（2）试验时应严格无菌操作，以防杂菌污染。
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（1）实验菌株 *（atcc 6538）、大肠杆菌（8099）、白色念珠菌（atcc 10231），也可根据抑菌剂特定用途选用其他菌株
（2）磷酸盐缓冲液
（3）培养基 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（tsa）胰蛋白胨大豆肉汤培养基（tsb）与沙堡琼脂培养基
（4）薄膜 不影响细菌生长和不吸水的材料，厚度不规定，使用一面应有较好的粘合性，面积为 40mm±2mm的正方形
（5）无菌塑料袋
（6）恒温水浴箱
（7）37℃恒温培养箱
（8）样片 将试样及对照试样（与试样同质不含抗菌组分）分别制成边长为 50mm±2mm的正方形，其中抗菌样片3个，对照样片6个。试验前，以脱脂棉蘸取酒精轻轻擦拭样片 2～3次，充分干燥
3 操作程序
（1）倾注琼脂培养基平板。
（2）将菌悬液用1/500的营养肉汤稀释成2.5×105cfu/ml～1.0×106cfu/ml实验用菌悬液。
（3）将样片试验面朝上放于无菌平皿中，取 0.4ml 菌悬液滴染于样片*，涂匀。按图表示的方法用薄膜覆盖，小心触压薄膜，使菌液均匀散开，盖上平皿盖。如图2-3
（4）将装有接种过菌液的试验样片的平皿（3个抗菌样片和3个对照样片），置35℃±１℃，相对湿度不低于 90% 的条件下，培养箱内培养24ｈ±１ｈ。
（5）洗脱 以无菌操作方式用镊子将覆盖膜和试验样片放入塑料袋中，然后加入10ml 肉汤培养液，用手充分揉搓袋中的试验样片和覆盖薄膜，将细菌洗下。
（6）吸取 1ml 洗下的菌液，至含 9ml pbs的试管中，做系列10倍稀释，取适当稀释度接种２个平皿，以倾注法加入 15ml～20ml tsa，置 35℃±１℃恒温培养箱内培养 40h～48h。
（7）将另 3 个对照样片接种后立即用镊子将覆盖膜和试验样片放入塑料袋中，洗脱和接种方法与试验样片相同。
（8）以试验用同批次稀释液、培养基等分别设阴性对照。
（9）试验重复3次。
4 活菌数的计算
ｎ＝ｃ×ｄ×ｖ
ｎ：为活菌数
ｃ：为2个平板的平均菌落数
ｄ：为稀释倍数
ｖ：为洗脱用肉汤培养基的液体的毫升数
5 结果的计算与判定
（1）试验成立应符合的条件
1）各次试验阴性对照均无菌生长
2）对照样片接种后直接求出活菌数的对数值符合下列公式
（lzui大值 - lzui小值）/l平均值≤0.2
公式中，lzui大值 zui大活菌数的对数值
lzui小值 zui小活菌数的对数值
l平均值 平均活菌数的对数值
3）对照样片接种后的活菌数平均值应为 1.0×105cfu/样片～4.00×105cfu/样片
4）覆盖了薄膜的对照样片培养 24h后的活菌数，每样片均不少于 1.0×104cfu。
（2）抗菌活性值的计算：
r=log（b/a）-log（c/a）=log（b/c）
r: 抗菌活性值
a: 对照样片在接种后的活菌数的平均值
b：对照样片在接种后培养24h的活菌数的平均值
c：抗菌样片在接种后培养24h的活菌数的平均值
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