whatman 3MM滤纸的应用
whatman 3mm滤纸的应用---杂交筛选——cdna序列作为探针
1．如上述将文库铺平板，噬菌斑杂交实验用e.coli宿主菌株y1088。
2．噬菌斑于42℃生长过夜。
3．从温箱取出平板，置4℃冷却至少1h。
4．膜剥离：首先，用软铅笔在干的硝酸纤维素滤膜上给准备影印的平板编号。其次，从平板的*开始向边缘小心将滤膜铺在菌台上。当滤膜*变湿后（颜色变灰），再等30s。同时，用针头在平板上标出滤膜的3个不对称位置。小心将滤膜从平板上剥离，接触面向上放在一张干净的whatman 3mm滤纸上。在进行下一步骤之前，所有的平板重复步骤4。
5．将滤膜接触面向上漂浮在变性液（0.5 mol/l naoh; 1.5 mol/lnacl）中5min。
6．中和5min。
7．用2×ssc洗涤5min。
8．将滤膜放在一张新的whatman3mm滤纸上，用铅箔将滤膜和滤纸一起包住。
9．在真空炉中80℃烘烤2h。
10．用6×ssc预先短暂地湿润滤膜，然后用预洗液（50 mmol/ltris-cl ph8.0; 1mol/l nacl; 1mmol/l edta; 0.1%sds）于68℃预洗涤至少1h。用一个盘子放在水浴摇床上。
11．将25张滤膜转移到一个装有50ml杂交液（5×sspe；1×denhardt's液；100μg/ml ct-dna；0.1％sds）的贮存罐内（直径至少90mm），68℃预杂交2h。
12．对于每ml杂交液，2倍的105至1×106cpm的双链探针经沸水浴变性10min后，迅速放冰上冷却。
13．变性探针立即加到预杂交混合液中。
14．在封口的贮存罐内于68℃杂交过夜，不断地晃动以防滤膜粘在一起。
15．杂交结束后，滤膜用2×ssc，0.01％sds于室温洗涤3次约1h。
16．将潮湿（防止干燥）的硝酸纤维素滤膜放在一张硬纸或x光片上，用放射性墨水在针头标签上作标记。
17．滤膜用塑料包装袋（如saran）包住，然后加上增感屏在x光片上于－70℃曝光过夜。
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5．将滤膜接触面向上漂浮在变性液（0.5 mol/l naoh; 1.5 mol/lnacl）中5min。
6．中和5min。
7．用2×ssc洗涤5min。
8．将滤膜放在一张新的whatman3mm滤纸上，用铅箔将滤膜和滤纸一起包住。
9．在真空炉中80℃烘烤2h。
10．用6×ssc预先短暂地湿润滤膜，然后用预洗液（50 mmol/ltris-cl ph8.0; 1mol/l nacl; 1mmol/l edta; 0.1%sds）于68℃预洗涤至少1h。用一个盘子放在水浴摇床上。
11．将25张滤膜转移到一个装有50ml杂交液（5×sspe；1×denhardt's液；100μg/ml ct-dna；0.1％sds）的贮存罐内（直径至少90mm），68℃预杂交2h。
12．对于每ml杂交液，2倍的105至1×106cpm的双链探针经沸水浴变性10min后，迅速放冰上冷却。
13．变性探针立即加到预杂交混合液中。
14．在封口的贮存罐内于68℃杂交过夜，不断地晃动以防滤膜粘在一起。
15．杂交结束后，滤膜用2×ssc，0.01％sds于室温洗涤3次约1h。
16．将潮湿（防止干燥）的硝酸纤维素滤膜放在一张硬纸或x光片上，用放射性墨水在针头标签上作标记。
17．滤膜用塑料包装袋（如saran）包住，然后加上增感屏在x光片上于－70℃曝光过夜。
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