稳定转染细胞株构建：方法与实践中的常见问题解析
随着生物技术的快速发展，稳定转染细胞株的构建在基础研究和应用研究中变得越来越重要。这一技术涉及到将外源基因稳定整合到宿主细胞基因组中，从而实现基因的长期表达。然而，这一过程也伴随着一系列的挑战和常见问题。本文将深入探讨稳转细胞株构建的方法，以及在实践过程中可能遇到的问题，旨在为研究者提供实用的指导和建议。
稳定转染细胞株构建方法：
一、慢病毒感染细胞；
慢病毒因为可以感染大多数的分裂细胞和非分裂细胞，包装技术成熟，ii代和iii代慢病毒包装系统均能包装高滴度的慢病毒，是稳转细胞系构建的首-选系统。但是因为慢病毒有包装容量限制，不适合转录本区域比较长的基因，对较大的基因有局限性。另外由于慢病毒是逆转录病毒，病毒表达载体中，是由wpre元件代替polya稳定以达到稳定mrna的作用，对部分基因的翻译有一定影响。
二、转座子介导的稳转细胞系构建；
转座子是存在于各种生命细胞内的可移动遗传信息元件，能实现dna片段在染色体内部/之间的转移。工程化的转座子由itr和转座酶编码基因组成，通过转座酶与itr结合实现基因转移。将转座子的两个元件分别构建在两个独立载体上，并将目的基因序列替换转座酶序列，与另一个载体共转染目的细胞，实现目的基因在宿主基因组上的整合。与其他技术不同，目的基因在整合酶存在下会持续处于切割—整合状态，实现连续跳跃。
三、crispr/cas9 基因敲入
利用crispr/cas9系统，通过nhej和hdr修复机制，可将目的基因（如抗性基因和荧光标志）定点敲入细胞基因组。在哺乳动物细胞中，nhej的效率高于hdr。设计特定sgrna和donor载体，可在aavs1位点（人基因组安全港）实现基因定点敲入。此方法稳定、安全，但敲入概率在不同细胞和位点中有所差异，需筛选单克隆以获得稳定细胞系。随着编辑效率提高，此方法将更省时省力。
四、crispr sam系统，通过融合vp64、ms2-p65-hsf1系统对基因进行过表达和干扰。
crispr sam通过dcas9-vp64、ms2-p65-hsf1激活蛋白实现了多数细胞内源基因的特异性激活，不受基因大小限制。主要优势是应用广泛，但需要三种不同抗性病毒逐次或同时感染细胞。crispr sam将sgrna序列构建在lenti载体中，配合其他两种慢病毒可激活任何基因。主要缺点是筛选细胞时需要三种不同抗性的病毒，部分细胞筛选后表型变化明显。
稳转细胞系构建中常见问题解析：
1. 是否需要进行密码子优化？
由于氨基酸密码子的简并性和trna的种类多样性、数量的差异，密码子优化对长基因稳转细胞系的构建有很强的必要性，可以大幅提高目标蛋白的表达量。
2. kozak序列是必须要添加的吗？
kozak序列（通常是gccaccatgg），真核生物mrna真正的起始密码子位于kozak序列的保守序列中，其共有序列是ccrccaugg，几乎所有mrna的翻译起始都依赖于5’帽子结构募集小亚基，少数通过内部核糖体进入位点(ires)募集小亚基。kozak序列通过与翻译起始因子eif形成翻译起始复合物，起始蛋白的翻译。
3. 启动子应如何选择？
cmv（巨细胞病毒）启动子除了在干细胞外，其他大多数细胞类型中均可以获得高表达活性。悬浮细胞中sffv启动子表达活性相对较高。而ef1a（延伸因子-1α）启动子更适用于表达长片段的基因。cmv；ef1a；cag；cbh；sffv，等均属于强启动子，都可作为稳转细胞系构建可选启动子。
4. 稳转细胞系培养体系
稳转细胞系一般建议用半抗性筛选浓度维持细胞生长，如hepg2细胞puro抗性筛选浓度为2μg/ml，则建议用1ug/ml+完-全培养基维持生长；部分基因过表达后会影响细胞代谢，尤其肿瘤细胞，糖酵解代谢速率受影响，细胞生长缓慢，可相应添加葡萄糖或者hepes调节细胞细胞代谢水平，维持细胞增殖。
5. 标签放在n端还是c端好？
如果n端有信号肽，建议放在c端；蛋白如果较小，建议放在c端，减少蛋白降解；如果下游有p2a，t2a等自剪切肽，建议放在c端。如果为了添加kozak序列，建议加在n端。如果纯化中需要酶切标签，建议放在n端。
6. 是否可以构建稳转敲除的细胞系？
一般不建议，因为敲除元件稳定持续的表达在细胞中，累积脱靶效应明显，影响细胞状态。
义翘神州提供稳定细胞系构建服务，包含过表达细胞系构建服务和cho稳定细胞株开发服务，其服务内容详情可以参看义翘身上网！
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一、慢病毒感染细胞；
慢病毒因为可以感染大多数的分裂细胞和非分裂细胞，包装技术成熟，ii代和iii代慢病毒包装系统均能包装高滴度的慢病毒，是稳转细胞系构建的首-选系统。但是因为慢病毒有包装容量限制，不适合转录本区域比较长的基因，对较大的基因有局限性。另外由于慢病毒是逆转录病毒，病毒表达载体中，是由wpre元件代替polya稳定以达到稳定mrna的作用，对部分基因的翻译有一定影响。
二、转座子介导的稳转细胞系构建；
转座子是存在于各种生命细胞内的可移动遗传信息元件，能实现dna片段在染色体内部/之间的转移。工程化的转座子由itr和转座酶编码基因组成，通过转座酶与itr结合实现基因转移。将转座子的两个元件分别构建在两个独立载体上，并将目的基因序列替换转座酶序列，与另一个载体共转染目的细胞，实现目的基因在宿主基因组上的整合。与其他技术不同，目的基因在整合酶存在下会持续处于切割—整合状态，实现连续跳跃。
三、crispr/cas9 基因敲入
利用crispr/cas9系统，通过nhej和hdr修复机制，可将目的基因（如抗性基因和荧光标志）定点敲入细胞基因组。在哺乳动物细胞中，nhej的效率高于hdr。设计特定sgrna和donor载体，可在aavs1位点（人基因组安全港）实现基因定点敲入。此方法稳定、安全，但敲入概率在不同细胞和位点中有所差异，需筛选单克隆以获得稳定细胞系。随着编辑效率提高，此方法将更省时省力。
四、crispr sam系统，通过融合vp64、ms2-p65-hsf1系统对基因进行过表达和干扰。
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1. 是否需要进行密码子优化？
由于氨基酸密码子的简并性和trna的种类多样性、数量的差异，密码子优化对长基因稳转细胞系的构建有很强的必要性，可以大幅提高目标蛋白的表达量。
2. kozak序列是必须要添加的吗？
kozak序列（通常是gccaccatgg），真核生物mrna真正的起始密码子位于kozak序列的保守序列中，其共有序列是ccrccaugg，几乎所有mrna的翻译起始都依赖于5’帽子结构募集小亚基，少数通过内部核糖体进入位点(ires)募集小亚基。kozak序列通过与翻译起始因子eif形成翻译起始复合物，起始蛋白的翻译。
3. 启动子应如何选择？
cmv（巨细胞病毒）启动子除了在干细胞外，其他大多数细胞类型中均可以获得高表达活性。悬浮细胞中sffv启动子表达活性相对较高。而ef1a（延伸因子-1α）启动子更适用于表达长片段的基因。cmv；ef1a；cag；cbh；sffv，等均属于强启动子，都可作为稳转细胞系构建可选启动子。
4. 稳转细胞系培养体系
稳转细胞系一般建议用半抗性筛选浓度维持细胞生长，如hepg2细胞puro抗性筛选浓度为2μg/ml，则建议用1ug/ml+完-全培养基维持生长；部分基因过表达后会影响细胞代谢，尤其肿瘤细胞，糖酵解代谢速率受影响，细胞生长缓慢，可相应添加葡萄糖或者hepes调节细胞细胞代谢水平，维持细胞增殖。
5. 标签放在n端还是c端好？
如果n端有信号肽，建议放在c端；蛋白如果较小，建议放在c端，减少蛋白降解；如果下游有p2a，t2a等自剪切肽，建议放在c端。如果为了添加kozak序列，建议加在n端。如果纯化中需要酶切标签，建议放在n端。
6. 是否可以构建稳转敲除的细胞系？
一般不建议，因为敲除元件稳定持续的表达在细胞中，累积脱靶效应明显，影响细胞状态。
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