【蛋白酶K小知识】蛋白酶K生产过程中的挑战
蛋白酶 k(proteinase k)是一种广谱丝氨酸蛋白酶,蛋白酶 k于1974年在fungus engyodontium album的提取物中发现。能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白(keratin)作为唯1碳源和氮源的环境中生长，说明该酶可以消化角蛋白，因此被称为“蛋白酶 k”。蛋白酶k由一条肽链组成，含有277个氨基酸，该蛋白的相对分子量~28.9kda，蛋白酶k是一种稳定且具有高活性的丝氨酸蛋白酶。晶体和分子结构研究证据表明该酶属于枯草素家族，具有活性位点催化三联体(asp39-his69-ser224)。蛋白酶k家族包含了各种由革兰氏阴性细菌、酵母及真菌分泌的细胞内肽酶。
蛋白酶k具有非常稳定的蛋白结构、超高的蛋白水解活性以及广泛的底物特异性，偏好于带有脂肪族及芳香烃的肽链，能优先分解与含硫氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸的羧基端连接的肽键。与其它的蛋白酶相比较，蛋白酶在一系列广泛的环境中均稳定：ph，缓冲盐，去污剂（sds）以及温度。如：该酶的活力不会被尿素、sds和edta等变性剂抑制，在高温、高盐或较高的ph等条件下，蛋白酶k仍能保持非常高活力。因该酶可以在较广的ph范围(4～12.5)内及高温(50～70℃)均有活性，在0.1-0.5% sds存在的情况下，蛋白酶k可保持活性，在不损害分离dna完整性的前提下，可以消化dna制剂中的多种蛋白质和核酸酶。
蛋白酶k /国家标准:
《蛋白酶k》（gb/t 34793-2017）是2018年5月1日实施的一项中华人民共和国国家标准，归口于中国标准化研究院。《蛋白酶k》（gb/t 34793-2017）规定了蛋白酶k产品的术语和定义、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输及贮存。《蛋白酶k》（gb/t 34793-2017）适用于生化试剂蛋白酶k产品的生产和检测。
蛋白酶k生产过程中的挑战：
①表达量低：由于蛋白酶k能够非特异性的降解大多数蛋白，因此在使用微生物表达生产该蛋白时，其表达的蛋白酶k可以对表达宿主中的有功能的蛋白进行水解，造成表达宿主不能持续的表达该蛋白，因此蛋白酶k的表达量很低。而筛选高表达量蛋白酶k的表达系统或菌株，需要花费大量的精力和较长的时间。
②不稳定性：虽然蛋白酶k可以在高温、高盐或较高的ph等苛刻的条件下保持很高的活性，但是该酶可以自己酶解自己，在无保护剂时，在37℃条件下很难长期稳定保存。
③该酶易沉淀：在制备蛋白酶k的冻干粉时，为了保证冻干粉中蛋白酶k的固含量维持在一个比较大的水平，通常需要在高浓度时加入冻干保护剂，然而在蛋白酶k浓度达到20mg/ml或者以上时，该酶很容易聚集形成沉淀，这给蛋白酶k的高固含量冻干造成了极大的挑战。
④生产投入大：在大规模发酵时，会产生大量色素和宿主核酸的残留，简单的纯化工艺很难除去这些杂质，而使用复杂的纯化工艺则会降低了回收率并且使生产成本加大。蛋白酶k具有很强的蛋白水解活性，能够将实验室或车间使用到的其它酶或蛋白水解，所以生产蛋白酶k需要专门的产地、仪器设备及配套设施。
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蛋白酶k /国家标准:
《蛋白酶k》（gb/t 34793-2017）是2018年5月1日实施的一项中华人民共和国国家标准，归口于中国标准化研究院。《蛋白酶k》（gb/t 34793-2017）规定了蛋白酶k产品的术语和定义、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输及贮存。《蛋白酶k》（gb/t 34793-2017）适用于生化试剂蛋白酶k产品的生产和检测。
蛋白酶k生产过程中的挑战：
①表达量低：由于蛋白酶k能够非特异性的降解大多数蛋白，因此在使用微生物表达生产该蛋白时，其表达的蛋白酶k可以对表达宿主中的有功能的蛋白进行水解，造成表达宿主不能持续的表达该蛋白，因此蛋白酶k的表达量很低。而筛选高表达量蛋白酶k的表达系统或菌株，需要花费大量的精力和较长的时间。
②不稳定性：虽然蛋白酶k可以在高温、高盐或较高的ph等苛刻的条件下保持很高的活性，但是该酶可以自己酶解自己，在无保护剂时，在37℃条件下很难长期稳定保存。
③该酶易沉淀：在制备蛋白酶k的冻干粉时，为了保证冻干粉中蛋白酶k的固含量维持在一个比较大的水平，通常需要在高浓度时加入冻干保护剂，然而在蛋白酶k浓度达到20mg/ml或者以上时，该酶很容易聚集形成沉淀，这给蛋白酶k的高固含量冻干造成了极大的挑战。
④生产投入大：在大规模发酵时，会产生大量色素和宿主核酸的残留，简单的纯化工艺很难除去这些杂质，而使用复杂的纯化工艺则会降低了回收率并且使生产成本加大。蛋白酶k具有很强的蛋白水解活性，能够将实验室或车间使用到的其它酶或蛋白水解，所以生产蛋白酶k需要专门的产地、仪器设备及配套设施。
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