辅酶ⅡNADP（H）含量的测定！
辅酶ⅱnadp(h)含量的测定！
辅酶ⅱnadp(h)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，nadp+和nadph分别是磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应中主要的氢受体和供体。nadp(h)含量和nadph/nadp+比值与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。较高的nadp(h)含量和nadph/nadp+比值说明细胞处于较强的磷酸戊糖代谢途径，生物合成能力旺盛，抗氧能力较强。nadph/nadp+比值升高也可抑磷酸戊糖途径的进行。
测定原理：
nadp+和nadph在254 nm下有吸收峰，利用高效液相色谱法在相应波长下测定其含量。
实验所用设备：
高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器（水系，50个，0.22μm）、滤膜（水系和有机系各2个，0.45μm）、c18柱（4.6 ×150 mm）、可调式移液器、样品瓶（50个，2ml）、乙腈（120 ml）、甲醇（色谱级，300 ml）、蒸馏水
试剂的组成：
试剂的组成及配制：
试剂一：粉剂1×1瓶，粉剂2×1瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1和粉剂2溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，形成nadp+和nadph提取液（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净），4℃保存3个月；
试剂二：粉剂1×1瓶，粉剂2×1瓶，粉剂3×1瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1、粉剂2和粉剂3溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至1000ml，形成流动相缓冲液基质（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净）, 4℃保存3个月。
试剂三：nadp+标准品5mg×1支，-20℃保存。加入1ml试剂一，配成5mg/ml 溶液，现配现用，用不完的试剂-20℃保存。
试剂四：nadph标准品5 mg×1支，-20℃保存。加入1ml试剂一，配成5mg/ml 溶液，现配现用，用不完的试剂-20℃保存。
1、将双蒸水1000 ml、流动相缓冲液基质1000 ml、甲醇300 ml和乙腈120 ml用0.45 μm的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：双蒸水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤，乙腈用有机系滤膜抽滤）。
2、流动相的配制：将抽滤完毕的流动相缓冲液基质1000 ml与乙腈配比为9：1（v/v），即取900ml缓冲液基质与100 ml乙腈混合。[每个样品需要约12ml流动相，流动相用量（ml）=12ml×样品数量+跑基线用量（约50ml），流动相的用量请根据样品数量用多少配多少]。
将抽滤完毕的甲醇和双蒸水配比成100%的甲醇，10%的甲醇，双蒸水各250 ml。
3、辅酶ⅱnadp(h)的提取：
组织处理：称取约0.1g组织，加入1ml试剂一，提取nadp+和nadph，。20000g4℃离心30 min，取上清液用0.22μm水系针头式过滤器过滤后待测。
细胞处理：收集约30 ml细胞，离心菌体，加入1ml 试剂一。超声破壁细胞(950 w，30%，15 min，工作2 s，间隔1 s)，再经10000g4℃离心40 min，上清用0.22μm水系微孔滤膜过滤后直接上柱检测。
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测定原理：
nadp+和nadph在254 nm下有吸收峰，利用高效液相色谱法在相应波长下测定其含量。
实验所用设备：
高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器（水系，50个，0.22μm）、滤膜（水系和有机系各2个，0.45μm）、c18柱（4.6 ×150 mm）、可调式移液器、样品瓶（50个，2ml）、乙腈（120 ml）、甲醇（色谱级，300 ml）、蒸馏水
试剂的组成：
试剂的组成及配制：
试剂一：粉剂1×1瓶，粉剂2×1瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1和粉剂2溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，形成nadp+和nadph提取液（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净），4℃保存3个月；
试剂二：粉剂1×1瓶，粉剂2×1瓶，粉剂3×1瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1、粉剂2和粉剂3溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至1000ml，形成流动相缓冲液基质（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净）, 4℃保存3个月。
试剂三：nadp+标准品5mg×1支，-20℃保存。加入1ml试剂一，配成5mg/ml 溶液，现配现用，用不完的试剂-20℃保存。
试剂四：nadph标准品5 mg×1支，-20℃保存。加入1ml试剂一，配成5mg/ml 溶液，现配现用，用不完的试剂-20℃保存。
1、将双蒸水1000 ml、流动相缓冲液基质1000 ml、甲醇300 ml和乙腈120 ml用0.45 μm的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：双蒸水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤，乙腈用有机系滤膜抽滤）。
2、流动相的配制：将抽滤完毕的流动相缓冲液基质1000 ml与乙腈配比为9：1（v/v），即取900ml缓冲液基质与100 ml乙腈混合。[每个样品需要约12ml流动相，流动相用量（ml）=12ml×样品数量+跑基线用量（约50ml），流动相的用量请根据样品数量用多少配多少]。
将抽滤完毕的甲醇和双蒸水配比成100%的甲醇，10%的甲醇，双蒸水各250 ml。
3、辅酶ⅱnadp(h)的提取：
组织处理：称取约0.1g组织，加入1ml试剂一，提取nadp+和nadph，。20000g4℃离心30 min，取上清液用0.22μm水系针头式过滤器过滤后待测。
细胞处理：收集约30 ml细胞，离心菌体，加入1ml 试剂一。超声破壁细胞(950 w，30%，15 min，工作2 s，间隔1 s)，再经10000g4℃离心40 min，上清用0.22μm水系微孔滤膜过滤后直接上柱检测。
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