3T3-L1细胞培养及经典“鸡尾酒”诱导攻略
流行性肥胖是近几年的一大健康挑战，肥胖促使一些心血管疾病如高血压、血栓等发病率增高，糖尿病则是以高血糖为特征的代谢性疾病，长期存在可导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。3t3-l1细胞——小鼠胚胎成纤维细胞（前脂肪细胞）系具有向脂肪细胞分化的特性，被广泛用于研究糖尿病，肥胖症等。
(图一）3t3-l1细胞形态
（表一） 3t3-l1基础培养信息
细胞名称 3t3-l1（小鼠胚胎成纤维细胞）
来源 18 天左右胎龄的 swiss 小鼠胚胎
生长方式 贴壁生长
细胞形态 成纤维细胞样
培养条件 95%空气 5%co237℃
推荐营养体系 dmem（abs9483）+10% nbcs（abs978）+1%p/s（abs9244）
传代 0.25%try（abs47014937）消化5-15min 1:3-1:4传代
冻存液配制 完quan培养基+5%dmso(abs9187)
培养小提示：1、never allow culture to become completely confluent.！！！细胞汇合度达到70-80%时进行传代。2、为了避免细胞聚团，在等待细胞消化的过程中，不要通过击打或摇晃瓶子来刺激细胞。难以消化的细胞可以放置在37℃。3、正常培养（非脂肪诱导期）出现空泡时，请优先考虑环境压力。造成压力的原因包括培养基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌药物、培养基中二氧化碳、碳酸氢钠浓度不当或培养基的营养物质耗尽。4、使用胎牛血清可能会造成细胞分化！！！
3t3－l1成脂诱导“鸡尾酒”策略（图二）3t3-l1细胞（正常）和3t3-l1成脂分化后（对照）
一般认为，细胞的增值和分化呈负相关，细胞开启分化必先退出分裂增值周期，常用的方法就是让其生长至融合期，出现接触抑制。脂肪生成是一个将碳水化合物和其他底物转化为脂肪酸，然后作为tags（甘油三酯）储存起来的过程。经典“鸡尾酒”法中，胰岛素样生长因子（igf-1）激活有丝分裂原蛋白激酶途径诱导细胞分化、camp磷酸二酯酶抑制剂（ibmx）通过激活camp 依赖性蛋白激酶途径增强 ccaat/增强子结合蛋白家族 (c/ebps)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ( pparγ) 表达促进成脂分化、地塞米松促进c/ebps的表达。
3t3－l1经典成脂诱导过程
诱导步骤：将融合后的3t3-l1（汇合度100%）细胞从dmem生长培养基切换到含有0.5 mmol/l ibmx（abs817348）、10 mg/ml胰岛素和1μmol/l地塞米松的分化培养基中48h。然后将细胞维持在含有10%fbs和10 mg/ml胰岛素的dmem培养基中48h，之后每隔一天更换常规新鲜培养基，一般第九天染色。
ps:不同产品活性纯度不同，浓度仅供参考，不同诱导方案略有差异，ibmx（abs817348）用dmso溶解时需要超声破碎。
染色：油红o储存液与超纯水按 3:2 稀释混匀，过滤，避光静置后酒红色且无沉淀，现配现用,2h内用完。用 pbs 磷酸缓冲液小心漂洗细胞三次，以2ml/孔（六孔板）的剂量加入4%多聚甲醛，室温固定40min，再用蒸馏水漂洗2次，每孔加入油红o工作液1ml，常温染色15min，蒸馏水漂洗至无残渣，蒸馏水漂洗后加入pbs镜下观察。
ps:清洗细胞时动摇要轻柔，防止脂滴脱落，油红o工作液一定要过滤至无沉淀，否则染色后有残渣且较难冲洗！！！
“鸡尾酒”诱导策略进击版有研究者探索了葡萄糖浓度和诱导液2（含10mg/ml胰岛素的低糖培养基）的作用时间对3t3l1细胞成脂分化率的影响，结果显示，低糖培养基诱导时成熟脂肪细胞形成率明显增高，诱导液2作用时间为3d时，成熟脂肪细胞形成率明显高于其他组。
注：文中图片来源于网络，仅供学习参考用
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货号 产品名称 规格
abs9483 dmem高糖培养基（含 l-谷氨酰胺，含丙酮酸钠，不含hepes） 500ml
abs978 新生牛血清（优级） 500ml
abs9244 青霉素-链霉素溶液（100×，双抗） 100ml
abs47014937 胰蛋白酶消化液（0.25%，含酚红） 100ml
abs9187 二甲基亚砜（细胞培养级） 50ml
abs817348 ibmx 25mg
abs9294 油红o染色液-改良型 3×20ml
参考文献[1] ling hy, wen gb, feng sd, tuo qh, ou hs, yao ch, zhu by, gao zp, zhang l, liao df. microrna-375 promotes 3t3-l1 adipocyte differentiation through modulation of extracellular signal-regulated kinase signalling. clin exp pharmacol physiol. 2011 apr;38(4):239-46. doi: 10.1111/j.1440-1681.2011.05493.x. pmid: 21291493; pmcid: pmc3086632.[2] [1]张轶博,钟悦,曾瑞霞.hamlet诱导小鼠前脂肪细胞3t3-l1成脂分化[j].锦州医科大学学报[3] [1]张晓琴. 优化3t3l1细胞成脂诱导模型并初步探讨mir-222-3p对脂肪生成的作用[d].湖北中医药大学
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试剂 | 耗材 | 仪器 | 软件 | 定制 | 实验服务 | 供应链
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传代 0.25%try（abs47014937）消化5-15min 1:3-1:4传代
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染色：油红o储存液与超纯水按 3:2 稀释混匀，过滤，避光静置后酒红色且无沉淀，现配现用,2h内用完。用 pbs 磷酸缓冲液小心漂洗细胞三次，以2ml/孔（六孔板）的剂量加入4%多聚甲醛，室温固定40min，再用蒸馏水漂洗2次，每孔加入油红o工作液1ml，常温染色15min，蒸馏水漂洗至无残渣，蒸馏水漂洗后加入pbs镜下观察。
ps:清洗细胞时动摇要轻柔，防止脂滴脱落，油红o工作液一定要过滤至无沉淀，否则染色后有残渣且较难冲洗！！！
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