菌种鉴定的实验方法和步骤 @古朵生物
1.实验安排
实验准备；
采样、恒温培养富集及初筛；
观察产气情况及稀释、倒培养基、划线、涂布、倒置培养；
鉴定、接种；
菌种保藏。
2.具体操作步骤实验准备
①配置培养基(伊红美兰琼脂培养基：7.4g+200ml无菌水、调ph7.2～7.4，营养琼脂培养基：6.6g+200ml无菌水、调ph7.4±0.2,0.85%生-理盐水、乳糖胆盐液体培养基2.6g+100ml无菌水，调ph7.4±0.2),装瓶，高压蒸汽灭菌。
②包扎好培养皿，移液管，试管，进行干热灭菌。
③将配好的乳糖胆盐液体培养基分装入三个试管中，每个大约十毫升，包扎，灭菌。
④液体石蜡和涂布棒等其他实验玻璃器进行灭菌。
采样、培养
取水，湖水，废水三样约2～3滴于3支已灭菌的乳糖胆盐液体培养基试管中，贴好标签（采样时间、人物、温度，采样地点及天气情况），塞好棉塞，于恒温箱（37℃）培养18～24小时；
观察产气情况、稀释
①观察产气管有无气柱，标记阳性管数。
②样品稀释：
对已灭菌的5只试管编号（分别为1、2、3、4、5号），从样液试管取1ml样品液放入盛有9ml生-理盐水的试管中为1号试管，换一只移液管，按上述方法依次配置5份10倍系列稀释液。贴明标签。
划线、涂布
①涂布平板法：
将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。
涂布平板法操作：
1.取少量菌液（不超过0.1ml），滴加到培养基表面；
2.用灭菌过的涂布棒或一次性涂布棒将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注意：1.将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
2.操作中一定要注意防火！不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。）
②平板划线法：
经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散。在37℃经培养24小时后，可在平板表面得到单菌落。（有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。）
鉴定
观察emb平板，菌落呈紫黑色，具有或略有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深，选取符合上述特征的单个菌落进行革兰氏染色，镜检（油镜）观察是否为无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。
培养
a.将菌落转入装有玻璃珠的灭菌锥形瓶中调节酸碱度为7，充分摇匀备用。
b.液体发酵：取处理好的样品液1ml加入灭菌的乳糖胆盐液体培养基中。摇匀后置培养箱中37℃培养24小时
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2.具体操作步骤实验准备
①配置培养基(伊红美兰琼脂培养基：7.4g+200ml无菌水、调ph7.2～7.4，营养琼脂培养基：6.6g+200ml无菌水、调ph7.4±0.2,0.85%生-理盐水、乳糖胆盐液体培养基2.6g+100ml无菌水，调ph7.4±0.2),装瓶，高压蒸汽灭菌。
②包扎好培养皿，移液管，试管，进行干热灭菌。
③将配好的乳糖胆盐液体培养基分装入三个试管中，每个大约十毫升，包扎，灭菌。
④液体石蜡和涂布棒等其他实验玻璃器进行灭菌。
采样、培养
取水，湖水，废水三样约2～3滴于3支已灭菌的乳糖胆盐液体培养基试管中，贴好标签（采样时间、人物、温度，采样地点及天气情况），塞好棉塞，于恒温箱（37℃）培养18～24小时；
观察产气情况、稀释
①观察产气管有无气柱，标记阳性管数。
②样品稀释：
对已灭菌的5只试管编号（分别为1、2、3、4、5号），从样液试管取1ml样品液放入盛有9ml生-理盐水的试管中为1号试管，换一只移液管，按上述方法依次配置5份10倍系列稀释液。贴明标签。
划线、涂布
①涂布平板法：
将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。
涂布平板法操作：
1.取少量菌液（不超过0.1ml），滴加到培养基表面；
2.用灭菌过的涂布棒或一次性涂布棒将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注意：1.将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
2.操作中一定要注意防火！不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。）
②平板划线法：
经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散。在37℃经培养24小时后，可在平板表面得到单菌落。（有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。）
鉴定
观察emb平板，菌落呈紫黑色，具有或略有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深，选取符合上述特征的单个菌落进行革兰氏染色，镜检（油镜）观察是否为无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。
培养
a.将菌落转入装有玻璃珠的灭菌锥形瓶中调节酸碱度为7，充分摇匀备用。
b.液体发酵：取处理好的样品液1ml加入灭菌的乳糖胆盐液体培养基中。摇匀后置培养箱中37℃培养24小时
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