DFM技术在活细胞表面纳米尺的应用分享
暗场显微成像技术（dfm）和表面增强的拉曼光谱（sers）等新兴的分析技术, 已广泛应用于化学检测和生物传感的快速诊断分析。近期，卓立汉光集团拜访合肥工业大学食品与生物工程学院刘洪林教授课题组，课题组基于dfm和sers这两个关键技术，在开发活细胞膜表面纳米尺和猕猴桃软腐病致病菌属鉴定方面开展了相关研究工作。
首先为大家带来刘教授团队有关细胞膜表面纳米尺相关研究工作，该研究成果以“plasmon resonance energy transfer nanorulerfor pinpointingmolecular distance and interaction on the living cell membrane”为题发表在nano letters 期刊中（doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c01629）。
近年来，光学纳米尺的应用越来越广泛，如förster共振能转移(fret) 和纳米金属表面能转移(nset) 等是常用的光学纳米尺。其中fret具有良好的准确性，但其测量范围往往被限制在10 nm以内；nset克服了10nm的限制，具有较长的检测量程，但其在r0的确定和测量存在挑战。此外，依赖于荧光检测的传统纳米尺不可避免的存在自猝灭和光漂白等不稳定性。因此，开发可靠、有效的方法以提高纳米尺的稳定性和准确性，特别是在活细胞体系中，一直是令人着迷但富有挑战性的课题。pret是发生在供体纳米金属表面和受体分子间的非辐射能量转移过程，等离子体金属表面与共振分子偶极间的相互作用导致能量传递，这一过程可以通过高信噪比、稳定性和灵敏度的暗场显微镜观察。
近日，课题组报道了单个纳米金颗粒和单个分子偶极之间的pret现象。研究团队使用两种无竞争性结合的配体，即适体xq-2d-cy3和抗体anticd71，识别活细胞膜上同一受体蛋白cd71的不同位点；适体携带小分子荧光标签作为能量受体，抗体携带单粒径的金颗粒作为供体，观察到了能量供体与受体之间无任何“系绳”连接的pret现象。基于此原理，构筑了灵活的pret光学纳米尺，实现了活细胞表面分子距离和蛋白互作的观察与测量。有限元理论模拟和暗场成像实验结果一致表明，该pret纳米尺在活细胞膜表面测量位点分离距离和蛋白互作具有可行性和稳定性，在分析科学纳米尺度测量领域具有广泛的应用前景。
图1. pret纳米尺的理论可行性和探针表征
理论上，研究团队通过有限元分子动力学模拟了单个金颗粒和单分子偶极之间的pret过程。金颗粒具有强烈且连续的电场强度分布，单分子偶极的引入显著降低了电场强度，且表现出明显的距离依赖性。特别是两者分离距离r小于5 nm时，单个金颗粒和单分子偶极之间存在显著的pret能量转移。根据非辐射能量跃迁机制，pret能量损失可归因于共振受体和溶液介质通过偶极-偶极相互作用的非辐射能量传递。理论结果支持了单个金颗粒和单分子偶极之间pret效应的可行性。
图2. 活细胞膜上暗场显微镜原位观察pret过程
实验上，研究团队利用暗场显微镜在活细胞膜表面原位观察了pret过程，该暗场散射光谱数据采用北京卓立汉光仪器有限公司的rts系列暗场显微光谱系统检测。一方面，依据距离依赖的淬灭效率经验公式，计算得到pret能量转移效率为30±7%，进一步得到两个配体识别位点（适体xq-2d-cy3和抗体anticd71）之间的分离距离为16.3±1.5 nm；另一方面根据有限元模拟结果可以推导出两识别位点间距离范围为13.0-18.0nm。证明了该pret纳米尺具有一定的准确性、稳定性。
图3. 活细胞膜上流式细胞术原位观察nset过程
此外，研究团队还利用流式细胞术在活细胞膜表面观察了同一系统中与pret相反的能量转移过程——nset现象。即单独激发荧光标签（xq-2d-cy3）时，可以反向观察到xq-2d-cy3到金颗粒表面的能量转移过程。
图4. pret纳米尺测量活细胞膜表面分子距离和相互作用
转铁蛋白tf与适体xq-2d-cy3之间的竞争性结合，抑制了适体的结合，使得活细胞膜表面降低的金颗粒散射信号有所恢复，进一步验证了pret能量转移过程的发生，展现了该pret纳米尺测量分子分离距离、蛋白质互作、分子靶标识别等方面的可行性。
合肥工业大学刘洪林课题组简介
刘洪林，博士，教授，博士生导师，黄山学者，国家优秀青年科学基金获得者，国家重点研发计划项目首席科学家。入选合肥市高层次人才、安徽省级领军人才。获得中国科学技术大学理学学士和工学博士学位。主要从事食品安全领域的化学与生物传感分析、食品质量安全评价与监控技术研究。
已主持国家重点研发计划、国家优秀青年科学基金、省重点研发计划等项目10余项。已在nature commun.、j. am. chem. soc.、anal. chem.、food chem.、lwt等杂志发表论文50余篇，入选全球top 1%“esi”高引论文，获得安徽省自然科学论文一等奖、安徽省自然科学奖一等奖等奖励。
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