琼脂糖凝胶中DNA的回收（DEAE-纤维素膜电泳）
实验方法原理
从琼脂糖凝胶回收 dna 是通过电泳至带正电荷的 deae-纤维素膜上完成的。这种方法首先利用适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离 dna 片段，然后紧靠目的 dna 片段条带前方切一裂缝。将一长条 deae 纤维素膜插入裂缝。
实验材料
限制性内切核酸酶dna 样品dna 标准rna
试剂、试剂盒 乙酸铵deae 高盐洗脱缓冲液deae 低盐洗脱缓冲液edta 乙醇凝胶载样缓冲液naoh酚氯/仿醋酸钠te
仪器、耗材 琼脂糖凝胶deae 纤维素膜手提式长波紫外灯水浴
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
乙酸铵（10 mol/l)
deae 高盐洗脱缓冲液（50 mmol/l tris-cl (ph 8.0)，1 mol/l naci，10 mmol/l edta (ph 8.0)）
deae 低盐洗脱缓冲液（50 mmol/l tris-cl (ph 8.0)，0.15 mol/l nacl，10 mmol/l edta (ph 8.0)）
edta ( 10 mmol/l，ph 8.0)
乙醇
6x 凝胶载样缓冲液
0.5 mol/l naoh
酚: 氯/仿（1:1，v/v)
醋酸钠（3 mol/l，ph 5.2)
te ( ph 8.0)
2. 酶和缓冲液
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶，含有 0.5 μg/ml 的 eb
4. 核酸和寡聚核苷酸
dna 样品
dna 标准
rna，酵母转运 trna
5. 专用设备
deae 纤维素膜
手提式长波紫外灯
65℃ 水浴
二、方法
1. 消化一定量 dna 以收获至少 100 ng 目的片段 dna。用含有 0.5 μg/ml eb 的适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离 dna 片段。用手提式长波紫外灯对目的条带进行定位。
2. 用锋利的刀片或剃刀在紧靠目的条带前的凝胶上切一切口，其两边比条带宽约 2 mm。
3. 戴上手套，切一块与切口等宽而比凝胶稍深（1 mm ) 的 deae 纤维素膜。在 10 mmol/l edta ( ph 8.0) 室温浸泡 5 min 后，用 0.5 mol/l naoh 取代 edta 浸泡以活化 deae 纤维素膜。再次室温 5 min 后，用无菌水冲洗 6 次。
4. 用平头镊子将切口壁撑开，将膜插入裂缝中。取出镊子，使切口闭合，小心勿留气泡。
5. 继续电泳（<5 v/cm) 直至 dna 条带迁移到膜上。电泳过程中，可以用手提式长波紫外灯（302 nm ) 进行跟踪检测。
6. 当所有目的 dna 离开凝胶被收集到膜上时，切断电流。用平头镊子从凝胶中取出膜，室温下，用 5~10 ml deae 低盐缓冲液将膜漂洗一下，以除去膜上的琼脂糖。
7. 将膜转移到另一个微量离心管中，加足量的 deae 高盐洗脱缓冲液使膜完wan全被浸没。轻轻的将膜弄皱或对折，但不要压紧。盖上离心管盖，于 65℃ 温育 30 min。
8. 从膜上洗脱 dna 的过程中，对凝胶成像，记录被分离出的条带。
9. 步骤 7 的液体转移到另一微量离心管，再加入足量的 deae 高盐洗脱缓冲液，于 65℃ 温育 15 min。合并两份 deae 高盐溶液。
10. 高盐洗脱液用酚：氯/仿抽提一次。水相转移到另一离心管。加入 0.2 倍体积的 10 mol/l 乙酸铵，2 倍体积的 4℃ 乙醇。室温放置 10 min。用微量离心机室温以最大转速离心 10 min。用 70% 乙醇小心洗沉淀。打开离心管几分钟，使乙醇完wan全挥发。再将 dna 重溶到 3~5 μl te (ph 8.0)。
11. 如果需要极纯的 dna ( 如用于小鼠受精卵的显微注射或培养细胞电穿孔)，可以按照下述方法用乙醇再沉淀 dna。
(1) 用 200 μl te（ph 8.0）悬浮 dna，
加入 25 μl 3 mol/l 乙酸钠（ph 5.2），用 2 倍体积的乙醇重新沉淀 dna。
(2) 4℃ 微量离心机最大速度离心 5~15 min, 回收 dna。
(3) 70% 乙醇小心漂洗沉淀。打开离心管几分钟，使乙醇完wan全挥发。将 dna 溶于 3~5 μl te ( ph 8.0)。
12. 通过凝胶电泳对 dna 进行定性和定量。将少量（10~50 ng) 最终制备的 dna 片段与 10 μl te ( ph 8.0) 混合，加入 2 μl 所需的凝胶载样缓冲液。加样并在适当浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳，以已知量的经用适当限制酶消化的原 dna 作为参照物标准和分子质量标准。分离的片段应该与限制酶消化产物中的相应片段同步迁移。仔细检査凝胶，看是否有弱荧光带存在。弱荧光带存在表明有dna污染。
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一、材料
1. 缓冲液和溶液
乙酸铵（10 mol/l)
deae 高盐洗脱缓冲液（50 mmol/l tris-cl (ph 8.0)，1 mol/l naci，10 mmol/l edta (ph 8.0)）
deae 低盐洗脱缓冲液（50 mmol/l tris-cl (ph 8.0)，0.15 mol/l nacl，10 mmol/l edta (ph 8.0)）
edta ( 10 mmol/l，ph 8.0)
乙醇
6x 凝胶载样缓冲液
0.5 mol/l naoh
酚: 氯/仿（1:1，v/v)
醋酸钠（3 mol/l，ph 5.2)
te ( ph 8.0)
2. 酶和缓冲液
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶，含有 0.5 μg/ml 的 eb
4. 核酸和寡聚核苷酸
dna 样品
dna 标准
rna，酵母转运 trna
5. 专用设备
deae 纤维素膜
手提式长波紫外灯
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二、方法
1. 消化一定量 dna 以收获至少 100 ng 目的片段 dna。用含有 0.5 μg/ml eb 的适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离 dna 片段。用手提式长波紫外灯对目的条带进行定位。
2. 用锋利的刀片或剃刀在紧靠目的条带前的凝胶上切一切口，其两边比条带宽约 2 mm。
3. 戴上手套，切一块与切口等宽而比凝胶稍深（1 mm ) 的 deae 纤维素膜。在 10 mmol/l edta ( ph 8.0) 室温浸泡 5 min 后，用 0.5 mol/l naoh 取代 edta 浸泡以活化 deae 纤维素膜。再次室温 5 min 后，用无菌水冲洗 6 次。
4. 用平头镊子将切口壁撑开，将膜插入裂缝中。取出镊子，使切口闭合，小心勿留气泡。
5. 继续电泳（<5 v/cm) 直至 dna 条带迁移到膜上。电泳过程中，可以用手提式长波紫外灯（302 nm ) 进行跟踪检测。
6. 当所有目的 dna 离开凝胶被收集到膜上时，切断电流。用平头镊子从凝胶中取出膜，室温下，用 5~10 ml deae 低盐缓冲液将膜漂洗一下，以除去膜上的琼脂糖。
7. 将膜转移到另一个微量离心管中，加足量的 deae 高盐洗脱缓冲液使膜完wan全被浸没。轻轻的将膜弄皱或对折，但不要压紧。盖上离心管盖，于 65℃ 温育 30 min。
8. 从膜上洗脱 dna 的过程中，对凝胶成像，记录被分离出的条带。
9. 步骤 7 的液体转移到另一微量离心管，再加入足量的 deae 高盐洗脱缓冲液，于 65℃ 温育 15 min。合并两份 deae 高盐溶液。
10. 高盐洗脱液用酚：氯/仿抽提一次。水相转移到另一离心管。加入 0.2 倍体积的 10 mol/l 乙酸铵，2 倍体积的 4℃ 乙醇。室温放置 10 min。用微量离心机室温以最大转速离心 10 min。用 70% 乙醇小心洗沉淀。打开离心管几分钟，使乙醇完wan全挥发。再将 dna 重溶到 3~5 μl te (ph 8.0)。
11. 如果需要极纯的 dna ( 如用于小鼠受精卵的显微注射或培养细胞电穿孔)，可以按照下述方法用乙醇再沉淀 dna。
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加入 25 μl 3 mol/l 乙酸钠（ph 5.2），用 2 倍体积的乙醇重新沉淀 dna。
(2) 4℃ 微量离心机最大速度离心 5~15 min, 回收 dna。
(3) 70% 乙醇小心漂洗沉淀。打开离心管几分钟，使乙醇完wan全挥发。将 dna 溶于 3~5 μl te ( ph 8.0)。
12. 通过凝胶电泳对 dna 进行定性和定量。将少量（10~50 ng) 最终制备的 dna 片段与 10 μl te ( ph 8.0) 混合，加入 2 μl 所需的凝胶载样缓冲液。加样并在适当浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳，以已知量的经用适当限制酶消化的原 dna 作为参照物标准和分子质量标准。分离的片段应该与限制酶消化产物中的相应片段同步迁移。仔细检査凝胶，看是否有弱荧光带存在。弱荧光带存在表明有dna污染。
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