前沿 | 北京协和医学院张金兰/蒋建东团队揭示灯盏乙素通过调控Pdk-Pdc轴及线粒体有氧糖代谢挽救线粒体损伤
线粒体功能障碍被认为是衰老、阿尔茨海默病（ad）和血管性痴呆（vad）等的共同致病机制。然而，目前还没有发现特定的潜在分子可以通过调节线粒体代谢和修复线粒体损伤来治疗神经系统疾病。
灯盏乙素（sg）是来源于灯盏细辛中的一种黄酮类化合物，sg 已被证明具有广泛的心脑血管及神经变性保护药理活性。而线粒体是细胞的能量工厂，线粒体生物能缺陷及其导致的葡萄糖基础代谢降低是促进神经退行性病变等神经系统疾病的关键病理生理调节因子之一。神经细胞和脑组织的功能高度依赖线粒体功能，神经递质代谢与神经细胞的能量代谢密切相关，从能量代谢角度研究 sg 对线粒体及神经系统的保护作用具有重要意义。
近期北京协和医学院药物研究所/医药生物技术研究所张金兰教授/蒋建东院士团队在 advanced science（if=15.1）上发表了题为“scutellarin rescued mitochondrial damage through ameliorating mitochondrial glucose oxidation via the pdk-pdc axis”的研究[1]，该研究首次发现了灯盏乙素靶向脑组织线粒体丙酮酸脱氢酶激酶-丙酮酸脱氢酶复合物轴（pdk-pdc）调控线粒体有氧代谢，能够挽救受损的线粒体，进而发挥神经细胞保护的作用。研究结果表明，改善线粒体生物能缺陷的活性成分对神经系统疾病的治疗具有重要价值。
整体研究策略
研究团队建立了靶向线粒体代谢及功能的活性成分发现和药效评价方法：
首先基于活细胞能量代谢分析发现对线粒体有氧糖代谢有调控作用的活性物质
同时开展亚细胞水平线粒体蛋白组学、代谢组学和13c 同位素标记代谢流示踪研究，明确活性物质调控的代谢物流向和通量，以及调控的代谢酶
进一步基于激酶活性分析、质谱分析和分子生物学实验确证蛋白-活性成分的结合作用及结合口袋，最终揭示灯盏乙素靶向脑组织线粒体、调控线粒体有氧代谢及挽救受损的线粒体，进而发挥神经细胞保护的作用机制
研究结果
活细胞能量代谢分析
采用安捷伦 seahorse xfe96 analyzer进行活细胞能量代谢分析，活细胞能量代谢实时监测分析发现，sg 可同时增强糖酵解和氧化磷酸化（oxphos）过程，来缓解线粒体损伤导致的葡萄糖代谢低下。
图 1. nan3 诱导线粒体 oxphos 损伤和 sg 处理后实时 ecars 和 ocrs 的评估。a）糖酵解应激试验结果。b）对照组、模型组和 sg 治疗组糖酵解和糖酵解能力的 ecars。
蛋白组学研究
提取大鼠脑组织中的线粒体进行非标记定量蛋白质组学研究，结果显示线粒体组间差异蛋白主要与线粒体电子呼吸链及其上游糖酵解和 tca 循环途径密切相关。这表明 sg 可增强线粒体有氧呼吸及其上游途径，增加氢质子和电子供应，增强 oxphos 相关蛋白功能并最终降低线粒体损伤。
线粒体蛋白质组学揭示了 sg 对氧化磷酸化和能量代谢途径的调节作用。
代谢组学与代谢流研究
基于上述研究结果，进一步采用安捷伦 1290uhplc/6550q-tof开展了代谢组学和代谢流研究，以验证 sg 对线粒体损伤期间生物能缺乏的调节作用。
代谢组学分析表明 sg 显著增加了 tca 循环中富马酸和苹果酸的丰度，以及连接糖酵解和 tca 循环的关键代谢物丙酮酸的丰度。
图 2. a：主成分分析（pca）显示，对照组、模型组和 sg 组差异显著；b：27 种代谢物涉及的能量代谢相关途径分析
代谢流分析：对 sk-n-sh（人神经母细胞瘤细胞）细胞的糖酵解和三羧酸循环通路开展了 [13c6]-葡萄糖示踪分析。结果显示，sg 作用能显著逆转线粒体损伤下糖酵解过程中 [13c6]-葡萄糖-6-磷酸和 [13c3]-丙酮酸的丰度改变，而 [13c3]-乳酸丰度无显著差异，表明糖酵解增强并未通过乳酸代谢途径增加能量供应，而主要流向丙酮酸代谢。尤为重要的是，sg 显著增强了 [13c3]-丙酮酸到 [13c2]-乙酰辅酶 a 的代谢流量，从而增强了线粒体葡萄糖源的有氧呼吸。在 tca 循环中，sg 显著逆转了 [13c4]-琥珀酸、[13c4]-富马酸和 [13c4]-苹果酸代谢流量。总之，作者发现sg 通过 pdk-pdc 轴调节 [13c3]-丙酮酸到 [13c2]-乙酰辅酶 a 的流量是 sg 对抗线粒体 oxphos 损伤的关键点。
图 3.13c mfa 和 western blotting 结果显示 sg 能够调节葡萄糖-丙酮酸 - tca 循环过程相关的丙酮酸代谢
蛋白-活性成分的结合作用确证
基于激酶活性评估结果，进一步结合分子对接、免疫共沉淀（co-ip）、限制性蛋白水解-质谱（lip-ms）、药物亲和反应的靶点稳定性（darts）和细胞热转移分析（cetsa）等实验，作者得出结论，sg 与 pdk2 蛋白相互作用，并可能通过与 pdk2 的硫酰胺结合口袋（lipoamide-binding）结合来抑制其活性。
为验证 sg 通过调节 pdk-pdc 轴发挥线粒体保护和神经保护作用功能，作者构建了 shpdk2 sk-n-sh 细胞系（pdk2 基因敲低的 sk-n-sh 细胞系），发现sg 以 pdk2 为靶标对叠氮钠（nan3）诱导的线粒体膜电位损伤和线粒体有氧呼吸损伤发挥保护作用。此外，作者还通过蛋白质组学研究了 sg 对线粒体损伤引起细胞死亡的影响。差异蛋白在生物学过程分析中与多种凋亡过程有关。b 细胞淋巴瘤（bcl-2）家族的一组蛋白质与脑缺血中神经元死亡的调节密切相关。bcl-2 蛋白家族是线粒体外膜通透性的主要调节因子，在内在凋亡途径中发挥关键作用。细胞色素 c 被释放到胞质溶胶中，并通过细胞凋亡触发程序性细胞死亡。细胞色素 c 的释放及其介导的细胞凋亡由 bcl-2 家族控制。
在本研究中，作者发现 sg 在不同浓度下显著降低了由线粒体损伤引起的对照组 sk-n-sh 细胞凋亡，但在 shpdk2 sk-n-sh 细胞中没有观察到这种现象。同时，蛋白免疫印迹实验证实了线粒体损伤和 sg 给药对 bcl-2 蛋白、细胞色素 c 和其他凋亡相关蛋白的影响，表明sg 通过靶向 pdk2 调节线粒体依赖性细胞凋亡。
综上，该研究探索了新的潜在治疗方法：基于 pdk-pdc 轴治疗大脑低灌注引起的神经损伤和认知障碍，并发现 sg 通过特异性靶向 pdk2 发挥线粒体保护和抗凋亡活性。
图 4. sg 调节 pdk-pdc 轴和线粒体葡萄糖氧化发挥线粒体保护和抗凋亡活性
结论与展望
本研究开展了靶向 pdk-pdc 轴调控线粒体能量代谢的活性成分发现和机制研究工作：
基于组织病理、线粒体形态、线粒体关键参数、活细胞能量代谢分析等发现对线粒体有氧糖代谢调控作用的活性物质灯盏乙素
同时开展线粒体蛋白组学、代谢组学和13c 同位素标记代谢流研究，发现 sg 调控的代谢物通路和关键代谢物流量及其调控的代谢酶
然后基于激酶活性分析、质谱分析和分子生物学实验确证蛋白-小分子结合作用。通过以上研究发现了 sg 发挥神经保护的作用机制及靶点，即 sg 通过抑制 pdk2 增强 pdk-pdc 轴功能，促进了线粒体有氧糖代谢和线粒体膜电位，并进一步调节线粒体依赖性细胞凋亡发挥神经保护作用
本研究采用多组学、代谢流结合细胞能量代谢分析，同时与多种分子生物学实验交叉验证揭示了灯盏乙素通过调控 pdk-pdc 轴及线粒体有氧糖代谢挽救线粒体损伤的机制，为基于线粒体 pdk2 靶标的神经保护作用药物开发提供了新策略。
* 张金兰研究员和蒋建东院士为该论文的共同通讯作者；生宁副研究员、博士研究生张智慧与郑浩是该论文的共同第一作者。
参考文献：
[1]sheng n, zhang z, zheng h, ma c, li m, wang z, wang l, jiang j, zhang j. scutellarin rescued mitochondrial damage through ameliorating mitochondrial glucose oxidation via the pdk-pdc axis. adv sci. 2023 sep 26:e2303584.
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近期北京协和医学院药物研究所/医药生物技术研究所张金兰教授/蒋建东院士团队在 advanced science（if=15.1）上发表了题为“scutellarin rescued mitochondrial damage through ameliorating mitochondrial glucose oxidation via the pdk-pdc axis”的研究[1]，该研究首次发现了灯盏乙素靶向脑组织线粒体丙酮酸脱氢酶激酶-丙酮酸脱氢酶复合物轴（pdk-pdc）调控线粒体有氧代谢，能够挽救受损的线粒体，进而发挥神经细胞保护的作用。研究结果表明，改善线粒体生物能缺陷的活性成分对神经系统疾病的治疗具有重要价值。
整体研究策略
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研究结果
活细胞能量代谢分析
采用安捷伦 seahorse xfe96 analyzer进行活细胞能量代谢分析，活细胞能量代谢实时监测分析发现，sg 可同时增强糖酵解和氧化磷酸化（oxphos）过程，来缓解线粒体损伤导致的葡萄糖代谢低下。
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蛋白组学研究
提取大鼠脑组织中的线粒体进行非标记定量蛋白质组学研究，结果显示线粒体组间差异蛋白主要与线粒体电子呼吸链及其上游糖酵解和 tca 循环途径密切相关。这表明 sg 可增强线粒体有氧呼吸及其上游途径，增加氢质子和电子供应，增强 oxphos 相关蛋白功能并最终降低线粒体损伤。
线粒体蛋白质组学揭示了 sg 对氧化磷酸化和能量代谢途径的调节作用。
代谢组学与代谢流研究
基于上述研究结果，进一步采用安捷伦 1290uhplc/6550q-tof开展了代谢组学和代谢流研究，以验证 sg 对线粒体损伤期间生物能缺乏的调节作用。
代谢组学分析表明 sg 显著增加了 tca 循环中富马酸和苹果酸的丰度，以及连接糖酵解和 tca 循环的关键代谢物丙酮酸的丰度。
图 2. a：主成分分析（pca）显示，对照组、模型组和 sg 组差异显著；b：27 种代谢物涉及的能量代谢相关途径分析
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综上，该研究探索了新的潜在治疗方法：基于 pdk-pdc 轴治疗大脑低灌注引起的神经损伤和认知障碍，并发现 sg 通过特异性靶向 pdk2 发挥线粒体保护和抗凋亡活性。
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* 张金兰研究员和蒋建东院士为该论文的共同通讯作者；生宁副研究员、博士研究生张智慧与郑浩是该论文的共同第一作者。
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