NR2B、 p ERK、 p Elk21 共同参与大鼠逃避性学习和记忆
摘要 目的:探讨nr2b2perk2pelk21途径是否参与了大鼠各学习记忆相关脑区y2迷宫逃避性学习和记忆。方
法:健康雄性成年sd大鼠45只,共分为4组:①ifenprodil腹腔注射组（ifenprodilip,14只）,②dmso腹腔注射组
（dmsoip,15只）;③ifenprodil脑室注射组（ifenprodilic,8只）;④dmso脑室注射组（dmsoic,8只）。以y迷宫训
练和测试成绩作为行为学评定指标,用免疫组织化学和westernblot方法观察大鼠学习记忆相关脑区perk1/2和
pelk21的变化。结果:ifenprodilip组与dmsoip组动物的y迷宫学习成绩没有明显差异（p>0.05）,但ifenprodil
ip组y迷宫记忆成绩差于dmsoip组（p<0.05）。腹腔注射ifenprodil导致y迷宫训练后各脑区perk1/2和
pelk21表达的普遍下降,其中以海马、边缘区、杏仁核zui为明显,与dmsoip组相比差异有显著性（p<0.05）。
ifenprodilic组与dmsoic组*次y迷宫测试成绩没有明显差异（p>0.05）。*次测试后立即脑室给药并在
给药后6h测试y迷宫记忆再巩固成绩,发现ifenprodilic组成绩下降,与dmsoic组相比有明显差异（p<0.05）,
而且ifenprodilic组动物各脑区的perk1/2和pelk21表达与dmsoic组相比均普遍下降,其中pelk21表达在尾壳
核和边缘区几乎*消失。结论:nr2b对于大鼠y迷宫长期记忆的形成、记忆再巩固过程是必要的,nr2b的失
活将破坏这些过程。同时nr2b的失活减弱了y迷宫训练后及记忆再巩固测试后学习记忆相关脑区pelk21和
perk1/2表达,其中在尾壳核和边缘区,nr2b的失活使记忆再巩固测试后pelk21表达*被阻断。
关键词: nr2b; perk; pelk21; 学习和记忆; 信号转导; 大鼠
在神经元中,胞外信号反应激酶（extracellular
responsekinase,erk）途径在调节细胞存活和神经
元可塑性中起重要作用。erk下游靶目标包括突
触可塑性所必需的转录因子creb,elk21等。神经
元中erk活性被多条胞外信号途径的信号分子所
调节。nmda依赖的erk蛋白激酶的激活需要包
含有nr2b亚基的受体通道的开放和ca
2+
的进入。
ifenprodil作为一种nmda受体拮抗剂,可以
非典型性非竞争性地选择性结合于nr2b亚单位的
*结合位点,从而选择性地阻断含有nr2b亚
基的nmda受体的作用。nr2b亚基特异的nm2
da受体抑制剂ifenprodil以3μmol/l的浓度即可
抑制培养的海马神经元中60%的nmdar电流,同
时也使70%nmdar依赖的erk的激活受到抑
制[1]
。本实验即是通过对大鼠训练前腹腔注射
ifenprodil和记忆测试后脑室注射ifenprodil来观察
y迷宫学习记忆行为的变化并用免疫组织化学和
westernblot方法观察ifenprodil对y迷宫训练后大
鼠各学习记忆相关脑区perk1/2和pelk21表达的
影响,以探讨nr2b、perk1/2、pelk21信号通路是
否参与了y迷宫行为模式的学习记忆及记忆的再巩固。
1 材料与方法
1.1 动物
健康雄性成年sd大鼠45只,购自*军医大
学实验动物中心。体重200～300g。保持光照/黑
暗12h循环恒定,食物由实验中心提供,饮用自来
水。
1.2 实验分组
动物共分为4组:（1）ifenprodil腹腔注射组（ifenprodilip,14只）;（2）,dmso腹腔注射组（dm2
soip,15只）,此2组中分别有7只动物在训练后立
即处死,用来进行免疫组织化学染色;（3）ifenprodil
脑室注射组（ifenprodilic,8只）;（4）dmso脑室注
射组（dmsoic,8只）,分别在记忆测试后立即给与
脑室注射。
1.3 手术与给药
腹腔注射动物在训练前15min给药。将ifen2
prodil溶于二甲基亚砜（dmso）中,浓度为1.2mg/ml,注射量3mg/kg;dmso腹腔注射组注射同样体
积dmso。
脑室注射组动物在第2d记忆测试后立即经腹
腔注射10%*（0.4ml/100g）,固定于脑立
体定位仪上,双侧脑室钻孔（坐标:前囟后1.6mm,
中线两侧2.0mm,深3.5mm）,将药物通过玻璃电
极垂直缓慢注入,并留针10min。ifenprodil溶于
dmso中,浓度为2.0μg/μl,每侧注射0.5μl;dm2
so脑室注射组注射同样体积dmso。
1.4 电y迷宫中厌暗逃避反射训练电y型迷宫三条臂的尽头均有一灯,底部是电
网,实验时其中有一条臂末端的灯发出亮光,此时该
臂底部电网无电流通过,为安全区;另两臂末端的灯
不亮,底部电网通电（约50～70v）,为非安全区。
安全区与非安全区随机改变。每当大鼠到达安全区
30s后再随机改变安全区的位置,转变5s后非安
全区底部电网即有脉冲电流通过,刺激正常大鼠足
底而驱使其跑向安全区。大鼠在10s内从非安全
区一次性跑向安全区即被判为正确,否则均判为错
误。*天训练在每只大鼠上重复60次,记录正确
次数。少于25次视为不合格,弃去并及时补充动
物。ifenprodilip组及其对照dmsoip组在训练前15min腹腔注射。训练结束24h后（第二天）进行
y迷宫测试30次,记录正确次数。ifenprodilic和
dmsoic组在y迷宫测试后立即进行脑室注射,并
在6h后测试动物y迷宫记忆的再巩固。
1.5 免疫组织化学标本取材和染色
腹腔注射组动物进行第二天测试后立即腹腔内
注射10%*（4mg/100g）麻醉动物。经主
动脉4%多聚甲醛灌注固定。冠状冰冻切片,厚度
35μm。常规abc法染色,一抗分别为兔抗单克隆
perk1/2抗体（1∶200,cellsignalingtechnology公
司）和兔抗多克隆pelk21抗体（1∶100,cellsignaling
technology公司）。采用硫酸镍铵增强的二氨基联
苯胺（gdn）法显色。阴性对照用正常二抗同源血
清代替一抗,其它步骤相同。
1.6 数据的采集
pelk21免疫阳性神经元使用scionimage图像
分析系统,每只动物每个脑区选取5张切片,每张切片选择一个代表性视野在200倍光镜下检测平均光
密度。每只动物所选取切片层面基本相同,zui后计
算每组大鼠每个脑区pelk21免疫阳性神经元平均
光密度。perk1/2免疫阳性细胞计数在olympus显微镜100x物镜下进行,每只动物所取切片层面
基本相同,数目相同,各脑区均取5张连续切片,获
得该区阳性神经元均数,zui后计算每组大鼠每个脑
区perk1/2免疫阳性神经元平均数。
1.7 westernblot
脑室注射组记忆再巩固测试后立即断颈取脑,
置干冰上分离嗅球、前额叶、尾壳核、边缘区、海马、
小脑组织。低温匀浆,4℃,10000×g离心1h,
bradford法测蛋白浓度,变性后-80℃保存。sds2
page电泳:8%分离胶,5%分离胶,电泳完毕在半
干电转仪上将蛋白转移至硝酸纤维膜上,常规蛋白
免疫印迹染色,一抗分别为兔抗perk1/2抗体（1∶
1000,cellsignalingtechnology公司）及兔抗pelk21抗体（1∶1000,cellsignalingtechnology公司）,zui
后采用硫酸镍铵增强的二氨基联苯胺（gdn）法显
色。scionimage图象处理软件分析各泳道perk1/
2和蛋白条带光密度（od）值以及各自的参照泳道
od值。计算待检测泳道perk1/2和pelk21泳道
与各自相应的参照泳道的od比值。
1.8 统计学处理
所有数据以均数±标准差（…x±s）表示,统计分
析软件采用spss13.0,组间分析采用one2way
anova。2 结果
2.1 训练前腹腔注射ifenprodil对大鼠y迷宫学习
及24h后y迷宫记忆的影响
训练前15min腹腔注射ifenprodil组动物的y
迷宫学习成绩与dmsoip组相比,没有明显差异
（p>0.05）,但是在24h后测试动物的y迷宫记
忆,ifenprodilip组成绩差于dmsoip组成绩（p<
0.05,表1）
tab.1 effectofifenprodilperitonealinjectionbeforetraining
onraty2mazememory（times,…x±s）
groupnumber
y2mazescore
trainingtest
ifenprodilip735.42±5.7417.71±2.693
dmsoip835.00±3.6621.75±3.692.2 训练前腹腔注射ifenprodil对各学习记忆相关脑
区perk1/2和pelk21表达的影响
y迷宫训练后立即取标本检测两组大鼠perk1/2
和pelk21在各脑区的表达差异
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（dmsoip,15只）;③ifenprodil脑室注射组（ifenprodilic,8只）;④dmso脑室注射组（dmsoic,8只）。以y迷宫训
练和测试成绩作为行为学评定指标,用免疫组织化学和westernblot方法观察大鼠学习记忆相关脑区perk1/2和
pelk21的变化。结果:ifenprodilip组与dmsoip组动物的y迷宫学习成绩没有明显差异（p>0.05）,但ifenprodil
ip组y迷宫记忆成绩差于dmsoip组（p<0.05）。腹腔注射ifenprodil导致y迷宫训练后各脑区perk1/2和
pelk21表达的普遍下降,其中以海马、边缘区、杏仁核zui为明显,与dmsoip组相比差异有显著性（p<0.05）。
ifenprodilic组与dmsoic组*次y迷宫测试成绩没有明显差异（p>0.05）。*次测试后立即脑室给药并在
给药后6h测试y迷宫记忆再巩固成绩,发现ifenprodilic组成绩下降,与dmsoic组相比有明显差异（p<0.05）,
而且ifenprodilic组动物各脑区的perk1/2和pelk21表达与dmsoic组相比均普遍下降,其中pelk21表达在尾壳
核和边缘区几乎*消失。结论:nr2b对于大鼠y迷宫长期记忆的形成、记忆再巩固过程是必要的,nr2b的失
活将破坏这些过程。同时nr2b的失活减弱了y迷宫训练后及记忆再巩固测试后学习记忆相关脑区pelk21和
perk1/2表达,其中在尾壳核和边缘区,nr2b的失活使记忆再巩固测试后pelk21表达*被阻断。
关键词: nr2b; perk; pelk21; 学习和记忆; 信号转导; 大鼠
在神经元中,胞外信号反应激酶（extracellular
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元可塑性中起重要作用。erk下游靶目标包括突
触可塑性所必需的转录因子creb,elk21等。神经
元中erk活性被多条胞外信号途径的信号分子所
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含有nr2b亚基的受体通道的开放和ca
2+
的进入。
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非典型性非竞争性地选择性结合于nr2b亚单位的
*结合位点,从而选择性地阻断含有nr2b亚
基的nmda受体的作用。nr2b亚基特异的nm2
da受体抑制剂ifenprodil以3μmol/l的浓度即可
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。本实验即是通过对大鼠训练前腹腔注射
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1 材料与方法
1.1 动物
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1.2 实验分组
动物共分为4组:（1）ifenprodil腹腔注射组（ifenprodilip,14只）;（2）,dmso腹腔注射组（dm2
soip,15只）,此2组中分别有7只动物在训练后立
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1.3 手术与给药
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中线两侧2.0mm,深3.5mm）,将药物通过玻璃电
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网,实验时其中有一条臂末端的灯发出亮光,此时该
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不亮,底部电网通电（约50～70v）,为非安全区。
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30s后再随机改变安全区的位置,转变5s后非安
全区底部电网即有脉冲电流通过,刺激正常大鼠足
底而驱使其跑向安全区。大鼠在10s内从非安全
区一次性跑向安全区即被判为正确,否则均判为错
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y迷宫测试30次,记录正确次数。ifenprodilic和
dmsoic组在y迷宫测试后立即进行脑室注射,并
在6h后测试动物y迷宫记忆的再巩固。
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35μm。常规abc法染色,一抗分别为兔抗单克隆
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基本相同,数目相同,各脑区均取5张连续切片,获
得该区阳性神经元均数,zui后计算每组大鼠每个脑
区perk1/2免疫阳性神经元平均数。
1.7 westernblot
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2和蛋白条带光密度（od）值以及各自的参照泳道
od值。计算待检测泳道perk1/2和pelk21泳道
与各自相应的参照泳道的od比值。
1.8 统计学处理
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2.1 训练前腹腔注射ifenprodil对大鼠y迷宫学习
及24h后y迷宫记忆的影响
训练前15min腹腔注射ifenprodil组动物的y
迷宫学习成绩与dmsoip组相比,没有明显差异
（p>0.05）,但是在24h后测试动物的y迷宫记
忆,ifenprodilip组成绩差于dmsoip组成绩（p<
0.05,表1）
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groupnumber
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trainingtest
ifenprodilip735.42±5.7417.71±2.693
dmsoip835.00±3.6621.75±3.692.2 训练前腹腔注射ifenprodil对各学习记忆相关脑
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