施马伦贝格病毒探针法荧光定量PCR试剂盒
产品及特点
施马伦贝格病毒（schmallenberg virus，sbv）是一种rna病毒，是一种正本雅病毒属的新病毒，感染症状为发热、腹泻、乏力等，感染此病毒的奶牛产奶量降低，以及新生幼畜出现缺陷等。目前还没有发现它能感染人的证据，因此快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，本产品以探针法荧光定量rt-pcr技术为基础开发的专门检测施马伦贝格病毒的试剂盒。
它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品rna模板。
2.引物和探针经过优化，灵敏性高。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据施马伦贝格病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒
rna 发生交叉反应。
5.本产品足够50次20μl体系的探针法荧光定量rt-pcr反应。
6.本产品只能用于科研。
规格及成分
成分
编号
十孔盒包装
探针法qrt-pcr缓冲液
190504a
500μl（蓝盖）
探针法qrt-pcr酶混合液
190504b
100μl（红盖）
荧光pcr 专用模板稀释液
180701
1 ml（黄盖）
施马伦贝格病毒探针法qrt-pcr 引物混合液
15-90300yw
100μl（白盖）
施马伦贝格病毒qrt-pcr 探针
15-90300pb
50μl（棕色管）
施马伦贝格病毒探针法qpcr阳性对照(1×10e8拷贝/μl)
60908-90300pc
50μl（黄盖）
使用手册
15-90300sc
1 份
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂
样品rna。
使用方法
一、稀释标准曲线样品（以10e2-10e7拷贝/μl这6个10倍稀释度为例）。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的dna片段作为阳性对照。1.标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2.用带芯枪头分别加入45μl荧光pcr专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在7号管中加入5μl1×10e8拷贝/μl的阳性对照(试剂盒提供)，充分震
荡1分钟，得1×10e7拷贝/μl的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在6号管中加入5μl1×10e7拷贝/μl的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10e6拷贝/μl的标准曲线样品。放冰上待用
5.换枪头，在5号管中加入5μl1×10e6拷贝/μl的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10e5拷贝/μl的标准曲线样品。放冰上待用
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品rna的制备
7.如果有n个样品，最好设置n+2个提取，多出的一个是pc（样品制备阳性
对照），一个是nc（样品制备阴性对照）。可以用10μl阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为pc。另外用水作为nc。
8.用自选方法纯化样品的rna，本试剂盒跟市场上大多数rna提取试剂盒兼容。也可以向我公司购买柱式病毒rnaout。
三、probe qrt-pcr 反应（20μl 体系，在样品制备室进行）
9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记n+9个pcr管，其中n+2个用于上步得到的n+2个样品，1个用于pcr阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记n+4个pcr管，其中n+2个用于上步得到的n+2个样品，1个用于pcr阴性对照（用水做模板），1个用于pcr阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好
后最后加）
成分
样品管
n+2个
pcr 阴性
对照管
标准曲线
样品管（2-7 管）
探针法qrt-pcr缓冲液
各10μl
10μl
各10μl
探针法qrt-pcr酶混合液
各2μl
2μl
各2μl
施马伦贝格病毒qpcr 探针
各1μl
1μl
各1μl
施马伦贝格病毒探针法 qpcr 引物混合液
各2μl
2μl
各2μl
待测样本rna 模板
5μl
-
-
超纯水
-
5μl
-
第7步所得标准曲线样品稀释液
（2-7 号）
-
-
各5μl（2号样到
2号管，3号样到3号管…）
11.盖上盖子后上机，按下面参数进行qrt-pcr：
过程
温度
时间
逆转录
50℃
3 0min
预变性
94℃
1 0min
qrt-pcr反应
（40个循环）
94℃
15sec
60℃
1min（采集fam通道
的荧光信号）
四、数据处理
12.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的ct值从标准曲线上推算出样品rna浓度的log值，再推算出其浓度。
4.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照ct 必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于35，则为阳性。
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它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品rna模板。
2.引物和探针经过优化，灵敏性高。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据施马伦贝格病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒
rna 发生交叉反应。
5.本产品足够50次20μl体系的探针法荧光定量rt-pcr反应。
6.本产品只能用于科研。
规格及成分
成分
编号
十孔盒包装
探针法qrt-pcr缓冲液
190504a
500μl（蓝盖）
探针法qrt-pcr酶混合液
190504b
100μl（红盖）
荧光pcr 专用模板稀释液
180701
1 ml（黄盖）
施马伦贝格病毒探针法qrt-pcr 引物混合液
15-90300yw
100μl（白盖）
施马伦贝格病毒qrt-pcr 探针
15-90300pb
50μl（棕色管）
施马伦贝格病毒探针法qpcr阳性对照(1×10e8拷贝/μl)
60908-90300pc
50μl（黄盖）
使用手册
15-90300sc
1 份
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂
样品rna。
使用方法
一、稀释标准曲线样品（以10e2-10e7拷贝/μl这6个10倍稀释度为例）。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的dna片段作为阳性对照。1.标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2.用带芯枪头分别加入45μl荧光pcr专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在7号管中加入5μl1×10e8拷贝/μl的阳性对照(试剂盒提供)，充分震
荡1分钟，得1×10e7拷贝/μl的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在6号管中加入5μl1×10e7拷贝/μl的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10e6拷贝/μl的标准曲线样品。放冰上待用
5.换枪头，在5号管中加入5μl1×10e6拷贝/μl的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10e5拷贝/μl的标准曲线样品。放冰上待用
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品rna的制备
7.如果有n个样品，最好设置n+2个提取，多出的一个是pc（样品制备阳性
对照），一个是nc（样品制备阴性对照）。可以用10μl阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为pc。另外用水作为nc。
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9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记n+9个pcr管，其中n+2个用于上步得到的n+2个样品，1个用于pcr阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记n+4个pcr管，其中n+2个用于上步得到的n+2个样品，1个用于pcr阴性对照（用水做模板），1个用于pcr阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好
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成分
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各10μl
10μl
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各2μl
2μl
各2μl
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各1μl
1μl
各1μl
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各2μl
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-
-
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-
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-
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-
-
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2号管，3号样到3号管…）
11.盖上盖子后上机，按下面参数进行qrt-pcr：
过程
温度
时间
逆转录
50℃
3 0min
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94℃
1 0min
qrt-pcr反应
（40个循环）
94℃
15sec
60℃
1min（采集fam通道
的荧光信号）
四、数据处理
12.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的ct值从标准曲线上推算出样品rna浓度的log值，再推算出其浓度。
4.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照ct 必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于35，则为阳性。
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