蛋白质含量测定法
本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中zui常用、zui基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（biuret法）、folin－酚试剂法（lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（bradford法）。其中bradford法和lowry法灵敏度zui高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法
样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以*为例，其反应式如下：
h2o
o=cc=o
hnnh
r-chch-r
o=ccuc=o
hnnh
r-chch-r
h2o
反应（1）、（2）在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白
氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
五种蛋白质测定方法比较如下：
方法灵敏度时间原理干扰物质说明
凯氏定氮法
（kjedahl法）灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为±2％费时
8～10小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三录乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长
双缩脲法（biuret法）灵敏度低
1～20mg中速
20~30分钟多肽键＋碱性cu2＋?紫色络合物硫酸铵；
tris缓冲液；
某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似
紫外吸收法较为灵敏
50～100mg快速
5～10分钟蛋白质中的*和*残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；
各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正
folin－酚试剂法（lowry法）灵敏度高
～5mg慢速
40～60
分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被tyr和phe还原硫酸铵；
tris缓冲液；
*；
各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；
颜色深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法（bradford法）灵敏度zui高
1～5mg快速
5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液；
tritonx-100;
sds的方法；
干扰物质少；
颜色稳定；
颜色深浅随不同蛋白质变化
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蛋白质含量测定法，是生物化学研究中zui常用、zui基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（biuret法）、folin－酚试剂法（lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（bradford法）。其中bradford法和lowry法灵敏度zui高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法
样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以*为例，其反应式如下：
h2o
o=cc=o
hnnh
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hnnh
r-chch-r
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反应（1）、（2）在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白
氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
五种蛋白质测定方法比较如下：
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凯氏定氮法
（kjedahl法）灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为±2％费时
8～10小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三录乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长
双缩脲法（biuret法）灵敏度低
1～20mg中速
20~30分钟多肽键＋碱性cu2＋?紫色络合物硫酸铵；
tris缓冲液；
某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似
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5～10分钟蛋白质中的*和*残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；
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40～60
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*；
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考马斯亮蓝法（bradford法）灵敏度zui高
1～5mg快速
5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液；
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