PCR反应 模板核酸的提取办法汇总
pcr反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量。模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，pcr模板的制备尤为重要。模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能，决定分离模板核酸(dna或rna)的质和量及pcr的成败。而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等)。除去抑制taq dna聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的产量。
传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如sds等来破坏细胞组份，溶解细胞膜，使蛋白质变性，再用蛋白酶k来消化去除蛋白质，尤其是与dna结合的蛋白质，再用酚:抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供pcr实验用。但近几年来也发展了些 简便实用较为有效的标本消化处理方法。亦可满足pcr实验的要求。采用哪种方法消化 处理标本，视pcr实验的目的(是科研还是检测)及环境条件而定。
模板核酸的提取办法：
一、蛋白酶k消化裂解法：适用于所有标本的消化处理，尤以dna样品为佳。如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿，粪便等。
1、试剂配制
1）蛋白酶k消化液:10mmol/l tris.cl(ph8.0)
10mmol/ledta
150mmol/lnacl
0.5%sds
100～200ug/ml蛋白酶k.
2）蛋白酶k最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中。
2、提取方法:
有些标本、在用蛋白酶k消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组 织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等。
临床标本或经预处理的标本加蛋白酶k裂解液50～100ul.混匀，55℃1～3小时， 或37℃过夜。加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的:(49:1)抽提一 次，上清加入1/10体积的ph值5.23mmol/l醋酸钠缓冲液，加入2.5倍体积的冰冷无水 乙醇(或加等体积的异丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸 弃或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1～2次，特别小心的 吸弃或倒掉上清，真空或37℃温箱或室温干燥，加te缓冲液20ul.溶解后，取3～8ul 用于pcr扩增，或放-20℃保存。
蛋白酶k消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白k消化处理标本，经离心处理 后，吸取上清经95～97℃或煮沸10min灭活蛋白酶k后，直接作核酸模板用于pcr扩增。 如杂质较多，还可经酚:抽提后，即可用于pcr反应。此法蛋白质及其它杂质消除 *，taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性。但操作繁复，技术要求高。
二、直接裂解法:标本(组织细胞，分泌物)加pbs或生理盐水离心洗涤后，加消化 裂解液20～50ul(0.5%np-40和0.5%吐温-20)，95～98℃，15～30min以裂解病原体，裂解细胞。然后12000r/min离心5～10min，取上清20～30ul用于pcr扩增。血清标本可 直加等体积的消化液，加热处理离心后pcr扩增。亦有用5%的np-40和1.5%2-me做裂解 液，95℃30min消化处理，离心取上清，pcr扩增检测hbv dna.
三、碱变性法:取血清20ul，加入1mol/l naoh 20ul，37℃30min，离心，加 1mol/l hcl 20ul，离心后，取上清5ul，用于pcr扩增。*亦有用10ul血清加naoh至 0.2mol/l，37℃1h，再加hcl中和离心后取上清10ul做pcr，其特异性和敏感性较前法 更好。
四、煮沸法:经离心洗涤过的组织细胞，分泌物及血液标本，加适量无菌蒸馏水或pbs，混匀 后，100℃煮沸10～15min，14000r/min 10min，取上清做pcr.
五、碘化钠法:取组织细胞及抗凝血液10～100ul，加等体积的6mnai，反复轻混 20s，加等体积:(49:1)振匀后，离心取上清加0.6体积的异丙醇，混匀后 置室温3min.14000r/min 10min，沉淀加10～100ul，te溶解，取5～10ul做pcr，亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6m nai，0.5%十二烷基肌酸钠，10ug糖原，26mmol/l ph8.0 tris-hcl，13mmol/ledta)混匀后，60℃15min，加等体积异丙醇，离心沉定 后，加te液用于pcr扩增，其产量和质量较高。
六、异硫氰酸胍法
此法主要用于rna的提取。标本为组织细胞及血清等。
1、异硫氰酸胍消化液
异硫氰酸胍4mol/l
柠檬酸钠(ph7.0)25mmol/l
十二烷基肌酸钠0.5%
β-巯基乙醇0.1mol/l
2、消化方法:用50～100ul细胞悬液及血清，加等体积的异硫氰酸胍消化液振混匀 后，或65℃1小时，或室温放置数分钟，然后加1/10体积的3mmol/l ph5.2的醋酸钠缓 冲液，再加等体积的酚:，用力振摇约10s，10000r/min，离心5min，取上清加等 体积异丙醇-20℃放置3h后，14000r/min离心15min，沉定用75%冰冷乙醇离心洗涤1～ 2次，真空干燥，沉淀用te缓冲液溶解即可用于逆转录pcr扩增，或放-20℃保存。
其它消化处理标本提模板核酸的方法有①异硫氰酸胍一二氧化硅法②异硫氰酸胍-玻璃粉法。③chelex-100法。④全血直接扩增法⑤尿素消化裂解法。各有千秋，可根据情况选用。
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一、蛋白酶k消化裂解法：适用于所有标本的消化处理，尤以dna样品为佳。如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿，粪便等。
1、试剂配制
1）蛋白酶k消化液:10mmol/l tris.cl(ph8.0)
10mmol/ledta
150mmol/lnacl
0.5%sds
100～200ug/ml蛋白酶k.
2）蛋白酶k最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中。
2、提取方法:
有些标本、在用蛋白酶k消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组 织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等。
临床标本或经预处理的标本加蛋白酶k裂解液50～100ul.混匀，55℃1～3小时， 或37℃过夜。加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的:(49:1)抽提一 次，上清加入1/10体积的ph值5.23mmol/l醋酸钠缓冲液，加入2.5倍体积的冰冷无水 乙醇(或加等体积的异丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸 弃或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1～2次，特别小心的 吸弃或倒掉上清，真空或37℃温箱或室温干燥，加te缓冲液20ul.溶解后，取3～8ul 用于pcr扩增，或放-20℃保存。
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二、直接裂解法:标本(组织细胞，分泌物)加pbs或生理盐水离心洗涤后，加消化 裂解液20～50ul(0.5%np-40和0.5%吐温-20)，95～98℃，15～30min以裂解病原体，裂解细胞。然后12000r/min离心5～10min，取上清20～30ul用于pcr扩增。血清标本可 直加等体积的消化液，加热处理离心后pcr扩增。亦有用5%的np-40和1.5%2-me做裂解 液，95℃30min消化处理，离心取上清，pcr扩增检测hbv dna.
三、碱变性法:取血清20ul，加入1mol/l naoh 20ul，37℃30min，离心，加 1mol/l hcl 20ul，离心后，取上清5ul，用于pcr扩增。*亦有用10ul血清加naoh至 0.2mol/l，37℃1h，再加hcl中和离心后取上清10ul做pcr，其特异性和敏感性较前法 更好。
四、煮沸法:经离心洗涤过的组织细胞，分泌物及血液标本，加适量无菌蒸馏水或pbs，混匀 后，100℃煮沸10～15min，14000r/min 10min，取上清做pcr.
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2、消化方法:用50～100ul细胞悬液及血清，加等体积的异硫氰酸胍消化液振混匀 后，或65℃1小时，或室温放置数分钟，然后加1/10体积的3mmol/l ph5.2的醋酸钠缓 冲液，再加等体积的酚:，用力振摇约10s，10000r/min，离心5min，取上清加等 体积异丙醇-20℃放置3h后，14000r/min离心15min，沉定用75%冰冷乙醇离心洗涤1～ 2次，真空干燥，沉淀用te缓冲液溶解即可用于逆转录pcr扩增，或放-20℃保存。
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