10种免疫荧光检测方法详解！从入门到专业！
免疫荧光技术（immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。除了这些基本步骤，接下来的实验方法希望可以帮到您。
1. 细胞固定和通透
为达到蕞佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。步骤很重要，细胞和抗原需要保证蕞佳的结构，并利于抗体与抗原结合。通常情况下，
2. 抗体特异性
免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精-准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。
3. 合适的抗体稀释比例
通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下 1ug/ml 的纯化抗体或者 1:100-1:1000 的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第1次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。
4. 优化缓冲液和封闭剂
尽管很多抗原在常见的 buffer 如 pbs 中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。rockland 可提供优化过的 ihc 用封闭缓冲液，同样适用于荧光染色实验。
5. 选择正确的二抗
如果您需要做免疫实验，我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验；如果是双重甚至是多重染色，那么必须使用预吸附的二抗。同时，请优先选择来自同一物种的二抗。
6. 使用合适的细胞密度
选择合适的细胞数量进行染色，当细胞数量过多时，细胞结构不好，导致染色背景深，低细胞密度，会使细胞贴壁不佳，状态不好。
7. 多重染色
对同一样本进行两个不同抗原的检测时，可以用各自的抗体进行同时染色，但要求两个一抗的种属来源不同，标记物不同，而二抗的种属来源需保持一致。
8. 降低背景
高背景是免疫荧光常见的问题，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替 bsa 做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次五分钟，推荐洗涤液为 pbs+0.05%tween。
9. 封片
作为免疫荧光的蕞后一步，可以提高折射率，保护样品。
10. 数据分析
观察整体样片时，选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。
免疫荧光检测结果图
以上是10种检测方法，但是针对免疫荧光检测服务，推荐义翘神州，服务优势：
①技术员长期从事抗体质量控制工作，经验丰富。
②拥有包括nikon a1激光共聚焦显微镜等重要仪器，可满足您对样片、活细胞等样本的静态和动态观察拍摄。
③检测结果准确、重复性高，实验结果可直接用于论文发表。
更多免疫荧光检测服务详情可以参看cn.sinobiological com/services/immunofluorescence-service
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2. 抗体特异性
免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精-准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。
3. 合适的抗体稀释比例
通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下 1ug/ml 的纯化抗体或者 1:100-1:1000 的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第1次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。
4. 优化缓冲液和封闭剂
尽管很多抗原在常见的 buffer 如 pbs 中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。rockland 可提供优化过的 ihc 用封闭缓冲液，同样适用于荧光染色实验。
5. 选择正确的二抗
如果您需要做免疫实验，我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验；如果是双重甚至是多重染色，那么必须使用预吸附的二抗。同时，请优先选择来自同一物种的二抗。
6. 使用合适的细胞密度
选择合适的细胞数量进行染色，当细胞数量过多时，细胞结构不好，导致染色背景深，低细胞密度，会使细胞贴壁不佳，状态不好。
7. 多重染色
对同一样本进行两个不同抗原的检测时，可以用各自的抗体进行同时染色，但要求两个一抗的种属来源不同，标记物不同，而二抗的种属来源需保持一致。
8. 降低背景
高背景是免疫荧光常见的问题，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替 bsa 做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次五分钟，推荐洗涤液为 pbs+0.05%tween。
9. 封片
作为免疫荧光的蕞后一步，可以提高折射率，保护样品。
10. 数据分析
观察整体样片时，选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。
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